"Biofizyka"

Spis treści

1. Statystyczna ocena wyników pomiarów 15

1.1. Wprowadzenie. Pojęcie pomiaru (B. Rychlik) 15

1.1.1. Jednostki miar układu SI 15

1.1.1.1. Jednostki podstawowe 16

1.1.1.2. Jednostki pochodne 16

1.1.2. Dziesiętne wielokrotności i podwielokrotności jednostek miar 18

1.1.3. Jednostki miar spoza układu SI 18

1.2. Analiza błędow pomiarowych 20

1.2.1. Rodzaje i źrodła błędow pomiarowych 20

1.2.2. Określanie niepewności pomiarowej 20

1.2.2.1. Określanie niepewności pomiarowej wielkości mierzonej bezpośrednio 21

1.2.2.2. Określanie niepewności pomiarowej przy pomiarach pośrednich 21

1.3. Współzależność cech; korelacja i regresja liniowa (B. Rychlik) 22

1.4. Zmienna losowa, rozkłady zmiennej losowej (B. Rychlik) 24

1.5. Kryteria oceny metod analitycznych (M. Puchała) 25

1.6. Ćwiczenia. Rozkłady zmiennych losowych: Gaussa i Poissona (B. Rychlik) 28

Literatura 29

2.1. Gęstość ciał stałych i cieczy (M. Soszyński) 30

2. Ćwiczenia wprowadzające do biofizyki 30

2.1.1. Wyznaczanie gęstości ciał stałych i cieczy za pomocą wagi hydrostatycznej 32

2.1.2. Wyznaczanie gęstości względnej cieczy za pomocą piknometru 34

2.1.3. Wyznaczanie gęstości cieczy za pomocą areometru 35

2.1.4. Wyznaczanie gęstości płynów biologicznych metodą pomiaru prędkości opadania kropli 35

2.2. Elementy akustyki i ruch falowy (M. Soszyński) 37

2.2.1. Wyznaczanie prędkości rozchodzenia się dźwięku w ciele stałym za pomocą rury Kundta 41

2.2.2. Wyznaczanie częstości drgań widełek stroikowych metodą Quinckego 41

2.3. Wilgotność względna i bezwzględna powietrza (M. Soszyński) 42

Zasada działania psychrometru 43

2.4. Kalorymetria (M. Soszyński) 45

2.4.1. Wyznaczanie ciepła topnienia lodu 46

2.4.2. Wyznaczanie współczynnika rozszerzalności objętościowej cieczy za pomocą piknometru 48

2.4.3. Wyznaczanie ilości ciepła wydzielanego z organizmu człowieka przy oddychaniu 49

2.5. Zjawisko termoelektryczne. Wyznaczanie temperatury za pomocą termopary (M. Soszyński) 50

2.6. Pomiar oporu elektrycznego i siły elektromotorycznej (M. Soszyński) 53

2.6.1. Pomiar oporu elektrycznego przewodnika w układzie mostka Wheatstone'a 53

2.6.2. Pomiar siły elektromotorycznej (SEM) ogniwa metodą kompensacji 55

2.7. Oscyloskop katodowy (M. Soszyński) 57

2.8. Warstwa monomolekularna (M. Koter-Michalak) 60

Literatura 62

3.1. Podstawowe pojęcia termodynamiki klasycznej (M. Bryszewska) 63

3.1.1. Pojęcie układu, parametry układu, stan układu 63

3. Termodynamika 63

3.1.2. Pierwsza zasada termodynamiki; funkcje stanu 64

3.1.3. Druga zasada termodynamiki; procesy odwracalne i nieodwracalne. Entropia, entalpia swobodna 65

3.1.4. Entalpia swobodna reakcji chemicznych 67

3.1.5. Zadania rachunkowe z termodynamiki (M. Przybylska) 70

3.2. Ćwiczenia 79

3.2.1. Entalpia swobodna reakcji dysocjacji p-nitrofenolu (M. Koter-Michalak) 79

3.2.2. Entalpia swobodna oddziaływania ligandu z błoną komórkową.Wykres Scatcharda (A. Marczak) 80

3.2.3. Wyznaczanie E0' układu oksyhemoglobina/methemoglobina (A. Marczak) 83

3.2.4. Wyznaczanie współczynnika odbicia (A. Marczak) 86

3.2.5. Wyznaczanie mechanicznego współczynnika filtracji (M. Koter-Michalak) 88

Literatura 90

4.1. Podstawy spektroskopii UV-Vis (K. Gwoździński, A. Koceva-Chyła) 91

4.1.1. Charakterystyka promieniowania elektromagnetycznego i jego oddziaływania z materią 91

4. Spektrofotometria 91

4.1.2. Wiązania chemiczne w cząsteczkach 93

4.1.3. Przejścia elektronowe w cząsteczkach 96

4.1.4. Wpływ polarności rozpuszczalnika na widma UV 103

4.1.5. Prawa absorpcji promieniowania elektromagnetycznego i ich zastosowanie 105

4.1.6. Odchylenia od prawa Bouguera–Lamberta–Beera 109

4.1.7. Zastosowanie spektrofotometrii UV-Vi 112

4.2. Budowa i ogolna zasada działania spektrofotometrow UV-Vis (K. Gwoździński, A. Koceva-Chyła) 114

4.2.1. Podział spektrofotometrów 118

4.2.2. Parametry charakteryzujące spektrofotometry 119

4.3. Ćwiczenia 120

4.3.1. Prawo Bouguera–Lamberta–Beera. Wyznaczanie współczynników absorpcji (M. Puchała, A. Krokosz) 120

4.3.2. Spektrofotometryczne oznaczanie stężenia związku w mieszaninie dwuskładnikowej. Prawo addytywności absorpcji (M. Puchała, A. Krokosz) 121

4.3.3. Widma absorpcyjne rożnych form hemoglobiny. Spektrofotometr dwuwiązkowy w zakresie UV-Vis (M. Puchała, A. Krokosz) 123

4.3.4. Kinetyka reakcji utleniania hemoglobiny. Aktywność katalazy (M. Puchała, A. Krokosz) 128

4.3.5. Wpływ rożnych czynnikow na widma w zakresie UV-Vis (K. Gwoździński) 130

Literatura 131

5.1. Ogólna charakterystyka znaczników fluorescencyjnych (M. Bryszewska) 132

5. Zastosowanie znaczników fluorescencyjnych w badaniach błon biologicznych 132

5.1.1. Przykłady najważniejszych znaczników fluorescencyjnych 133

5.1.2. Procesy fizyczne zachodzące w cząsteczce znacznika po pochłonięciu przez nią fotonu 135

5.1.2.1. Absorpcja i fluorescencja 135

5.1.2.2. Polaryzacja fluorescencji 136

5.1.2.3. Gaszenie fluorescencji 139

5.1.3. Aparatura i pomiar fluorescencji znaczników 140

5.2. Badanie fizycznej struktury błon biologicznych za pomocą znaczników fluorescencyjnych (M. Bryszewska) 141

5.2.1. Oddziaływanie znaczników z błonami 141

5.2.2. Lokalizacja znaczników w błonach 142

5.2.3. Badanie ładunku powierzchniowego błon 143

5.2.4. Badanie ruchów cząsteczek w błonach 144

5.2.4.1. Badanie dyfuzji rotacyjnej w błonach 144

5.2.4.2. Badanie dyfuzji lateralnej w błonach 146

5.2.5. Badanie oddziaływań białkowo-lipidowych w błonach 148

5.2.6. Wyniki wybranych badań zmian błon komórkowych w stanach patologicznych przy użyciu znaczników fluorescencyjnych 150

5.3. Ćwiczenia 151

5.3.1. Ogolna budowa i zasada działania spektrofluorymetru (M. Puchała) 151

5.3.2. Charakterystyka spektralna związkow fluoryzujących w zakresie UV-Vis (M. Puchała) 152

5.3.3. Fluorymetryczne oznaczanie zawartości tryptofanu w białkach (M. Przybylska, M. Puchała) 155

5.3.4. Analiza dyfuzji lateralnej pirenu w błonach komórkowych krwinek czerwonych (M. Przybylska) 157

5.3.5. Badanie wpływu wybranych związkow chemicznych na mikrolepkość błony komórkowej erytrocytów metodą pomiaru współczynnika anizotropii fluorescencji TMA-DPH (M. Przybylska) 158

5.3.6. Oznaczanie potencjału błonowego krwinek czerwonych metodą fluorymetryczną (M. Przybylska) 161

5.3.7. Badanie szybkości transportu doksorubicyny przez błony komórkowe erytrocytow (M. Przybylska) 164

1-anilinonaftaleno-8-sulfonianu z błoną komorkową krwinek czerwonych (M. Przybylska) 166

5.3.8. Wyznaczanie parametru wiązania znacznika fluorescencyjnego 166

5.3.9. Wyznaczanie szybkości akumulacji daunorubicyny w błonach komórkowych fibroblastow metodą transferu energii (M. Przybylska) 169

Literatura 171

6. Spektrometria elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPR) 173

6.1. Podstawy spektroskopii EPR (K. Gwoździński, M. Koter-Michalak) 174

6.2. Rodniki nitroksylowe w metodzie znakowania spinowego (K. Gwoździński) 178

6.3. Metoda pułapkowania spinowego (K. Gwoździński) 186

6.4. Widma znaczników spinowych przyłączonych do lipidow i białek (K. Gwoździński, M. Koter-Michalak) 188

6.5. Budowa spektrometrow EPR (K. Gwoździński) 195

6.6. Ćwiczenia 197

6.6.1. Dobór niektórych parametrów związanych z rejestracją widm EPR (K. Gwoździński) 197

6.6.2. Wyznaczanie podstawowych parametrow widma EPR (K. Gwoździński) 198

6.6.3. Wpływ polarności oraz lepkości rozpuszczalnikow na widmo EPR (K. Gwoździński) 199

6.6.4. Badanie szybkości redukcji związków znakowanych spinowo w erytrocytach (K. Gwoździński) 200

6.6.5. Wyznaczanie energii aktywacji procesu redukcji nitroksydu we wnętrzu erytrocytow (K. Gwoździński) 201

6.6.6. Badania zmian konformacyjnych białek błonowych przy użyciu znacznika maleimidowego (K. Gwoździński) 203

6.6.7. Denaturacja termiczna znakowanej spinowo albuminy (K. Gwoździński, G. Bartosz) 204

6.6.8. Wyznaczanie parametru widmowego Tempo dla sztucznych błon fosfolipidowych (M. Koter-Michalak) 205

6.6.9. Badanie wpływu etanolu na stopień uporządkowania lipidów błony erytrocytarnej (M. Koter-Michalak) 206

6.6.10. Wyznaczanie mikrolepkości wnętrza erytrocytu (M. Koter-Michalak) 207

6.6.11. Badanie wolnych rodnikow w materiale biologicznym (M. Koter-Michalak) 208

Literatura 209

7.1. Turbidymetria i nefelometria (A. Koceva-Chyła) 210

7.1.1. Podstawy teoretyczne 210

7. Inne metody spektroskopowe 210

7.1.2. Ćwiczenia 214

7.1.2.1. Turbidymetryczne oznaczenie stężenia komórek (A. Koceva-Chyła) 214

7.1.2.2. Wyznaczanie przebiegu hemolizy krwinek na podstawie pomiaru zmian turbidancji (A. Koceva-Chyła) 215

7.2. Polarymetria (A. Koceva-Chyła, M. Puchała) 216

7.2.1. Podstawy teoretyczne 216

7.2.1.1. Światło niespolaryzowane 216

7.2.1.2. Polaryzacja światła, światło spolaryzowane 217

7.2.1.3. Sposoby polaryzacji światła 219

7.2.1.4. Polaryzatory i analizatory światła 222

7.2.1.5. Skręcenie płaszczyzny polaryzacji przez substancje optycznie czynne 225

7.2.1.6. Dichroizm kołowy (M. Puchała, A. Krokosz) 227

7.2.1.7. Dyspersja skręcalności optycznej i dichroizm kołowy (M. Puchała, A. Krokosz) 228

7.2.1.8. Skręcalność właściwa 229

7.2.1.10. Polarymetry — rodzaje i budowa 230

7.2.1.9. Oznaczanie kąta skręcenia płaszczyzny polaryzacji 230

7.2.1.11. Zasada pomiaru kąta skręcenia płaszczyzny polaryzacji w polarymetrze kołowym 231

7.2.2. Budowa i zasada działania polarymetru automatycznego POLAMAT A (A. Krokosz) 233

7.2.3. Ćwiczenia 235

7.2.3.1. Polarymetryczne oznaczenie stężenia i skręcalności właściwej sacharozy (A. Koceva-Chyła) 235

7.2.3.2. Aktywność optyczna aminokwasow i białek (M. Puchała, A. Krokosz) 236

7.3. Refraktometria (A. Koceva-Chyła) 237

7.3.1. Podstawy teoretyczne 237

7.3.1.1. Zjawiska odbicia i załamania światła w ośrodkach izotropowych 237

7.3.1.2. Zjawisko całkowitego wewnętrznego odbicia, kąt graniczny 240

7.3.1.3. Czynniki wpływające na wartość współczynnika załamania światła 241

7.3.1.4. Refrakcja molowa, refrakcja właściwa i egzaltacja 243

7.3.1.5. Zastosowanie pomiaru kąta granicznego w refraktometrii 245

7.3.1.6. Refraktometry — budowa i zasada działania 245

7.3.2. Ćwiczenia 247

7.3.2.1. Wyznaczenie zależności pomiędzy stężeniem a współczynnikiem załamania światła roztworów alkoholu etylowego i alkoholu metylowego (A. Koceva-Chyła) 247

7.3.2.2. Wyznaczenie stężenia białka w osoczu krwi metodą refraktometryczną (A. Koceva-Chyła) 249

Literatura 250

8.1. Potencjometria (A. Fortuniak) 251

8.1.1. Elektrody 251

8. Potencjometria i konduktometria 251

8.1.1.1. Elektroda wodorowa 252

8.1.1.2. Elektrody pierwszego rodzaju 252

8.1.1.3. Elektrody drugiego rodzaju 253

8.1.1.4. Elektrody trzeciego rodzaju 254

8.1.1.5. Elektrody redok 254

8.1.1.6. Elektrody tlenkowe 255

8.1.1.7. Elektrody jonoselektywne 255

8.1.1.7.1. Elektrody membranowe krystaliczne 256

8.1.2. Zastosowanie pomiarów potencjometrycznych 257

8.1.2.1. Pomiar pH 257

8.1.1.7.2. Elektrody membranowe heterogenne 257

8.1.1.7.3. Elektrody membranowe z ciekłym wymieniaczem 257

8.1.1.7.4. Elektrody enzymatyczne 257

8.1.2.2. Miareczkowanie potencjometryczne 258

8.1.2.2.1. Miareczkowanie metodą klasyczną 258

8.1.2.2.2. Miareczkowanie do punktu zerowego 259

8.1.2.2.3. Miareczkowanie metodą rożnicową 259

8.1.3. Zastosowanie pomiarów potencjometrycznych do wyznaczania stałych fizykochemicznych 260

8.1.2.2.4. Miareczkowanie z dwumetalicznym układem elektrod 260

8.2. Konduktometria (A. Fortuniak) 261

8.2.1. Zastosowanie pomiarów konduktometrycznych 262

8.2.1.1. Miareczkowanie konduktometryczne 262

8.2.1.2. Miareczkowanie alkacymetryczne 263

8.2.2. Konduktometria bezpośrednia 264

8.2.1.3. Miareczkowanie strąceniowe 264

8.2.3. Zastosowanie pomiarów konduktometrycznych 265

8.2.3.1. Wyznaczanie stałej dysocjacji 265

8.2.3.2. Wyznaczanie iloczynu rozpuszczalności 265

8.3. Ćwiczenia 266

8.3.1. Jonowe właściwości aminokwasow pH-metryczne wyznaczanie pK glicyny (A. Marczak) 266

8.3.2. Miareczkowanie kwasu ortofosforowego pH-metrycznie i wobec wskaźników pH (A. Marczak) 269

8.3.2.1. Miareczkowanie wobec wskaźników 270

8.3.3. Wyznaczanie przewodności elektrycznej erytroplazmy (M. Koter-Michalak) 271

8.3.2.2. Miareczkowanie pH-metryczne 271

Literatura 272

9.1. Lepkość biopolimerow (K. Gwoździński) 273

9.1.1. Lepkość, wiadomości ogolne 273

9. Wiskozymetria 273

9.1.2. Makrocząsteczka podczas przepływu 276

9.1.3. Pomiary lepkości 280

9.2. Ćwiczenia 283

9.2.1. Wyznaczanie współczynnika lepkości metodą Stokesa (M. Soszyński) 283

9.2.2. Pomiar lepkości względnej cieczy przy użyciu wiskozymetru kapilarnego (M. Soszyński) 284

9.2.3. Zastosowanie pomiarów lepkości do wyznaczania masy cząsteczkowej polimeru (K. Gwoździński) 285

Literatura 287

10.1. Wirowki (M. Puchała) 288

10. Wirowanie 288

10.2. Ultrawirowki (K. Gwoździński) 292

10.3. Określanie mas cząsteczkowych metodą szybkości sedymentacji (K. Gwoździński) 294

10.4. Wyznaczanie mas cząsteczkowych metodą rownowagi sedymentacyjnej (K. Gwoździński) 299

10.5. Sedymentacja w gradiencie gęstości (K. Gwoździński) 302

10.6. Równowaga sedymentacyjna w ustalonym gradiencie (K. Gwoździński) 306

10.7. Ćwiczenia 308

10.7.1. Wirowanie — ćwiczenie wstępne (A. Krokosz) 308

10.7.2. Termiczna denaturacja białka (M. Puchała) 309

10.7.3. Rozdział lipoprotein osocza metodą ultrawirowania (K. Gwoździński) 310

10.7.4. Rozdział mieszaniny kwasów rybonukleinowych metodą wirowania w gradiencie gęstości sacharozy (K. Gwoździński) 312

10.7.5. Oznaczanie pojedynczych pęknięć w DNA metodą ultrawirowania w gradiencie sacharozy alkalicznej (B. Rózga) 314

10.7.6. Oznaczanie superhelikalności nukleoidu DNA metodą ultrawirowania w gradiencie sacharozy neutralnej (B. Rózga) 319

Literatura 323

11.1. Ogólne zasady (G. Zaleśna) 324

11. Elektroforeza 324

11.1.1. Próbka 325

11.1.2. Bufory 325

11.1.3. Elektroendoosmoza 326

11.1.4. Zastosowanie metody 326

11.2. Ćwiczenia 327

11.2.1. Rozdział białek surowicy krwi człowieka na acetylocelulozie (W. Duda, G. Zaleśna) 327

11.2.2. Rozdział białek surowicy ludzkiej metodą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym (G. Zaleśna) 328

11.2.3. Oznaczanie masy cząsteczkowej białek metodą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym z SDS (wg Weber i Osborn, 1969) (G. Zaleśna) 330

11.2.4. Oznaczanie punktu izoelektrycznego białek metodą ogniskowania izoelektrycznego (G. Zaleśna) 332

Literatura 334

12.1. Podstawy teoretyczne, zastosowanie metody (K. Gwoździński) 335

12. Chromatografia 335

12.1.1. Chromatografia adsorpcyjna (K. Gwoździński) 336

12.1.1.1. Izotermy adsorpcji 338

12.1.1.2. Czynniki wpływające na rozdział chromatograficzny 340

12.1.1.3. Monitorowanie rozdziału w chromatografii kolumnowej 342

12.1.2. Chromatografia podziałowa (K. Gwoździński) 344

12.1.3. Chromatografia bibułowa (K. Gwoździński) 344

12.1.3.1. Identyfikacja chromatogramow 345

12.1.3.2. Zależność między wspołczynnikiem Rf a budową substancji 346

12.1.4. Chromatografia cienkowarstwowa (K. Gwoździński) 347

12.1.5. Filtracja żelowa (K. Gwoździński) 348

12.1.5.1. Złoża stosowane w chromatografii żelowej 349

12.1.5.2. Wspołczynniki podziału w chromatografii żelowej 350

12.1.5.3. Charakterystyka pasm i parametry kolumny chromatograficznej 351

12.1.5.4. Oznaczanie mas cząsteczkowych metodą chromatografii żelowej 354

12.1.6. Chromatografia jonowymienna (K. Gwoździński) 355

12.1.6.1. Rodzaje wymieniaczy jonowych 355

12.1.6.2. Parametry charakteryzujące wymieniacze jonowe 356

12.1.6.3. Bufory stosowane w chromatografii jonowymiennej 357

12.1.7. Wysokosprawna chromatografia cieczowa (K. Gwoździński) 359

12.1.6.4. Zastosowania chromatografii jonowymiennej 359

12.1.8. Chromatografia gazowa 363

12.2. Ćwiczenia 367

12.2.1. Zastosowanie metody filtracji żelowej do oznaczania masy cząsteczkowej białka (K. Gwoździński) 367

12.2.2. Oznaczanie stężenia adduktu MDA-TBA metodą wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej HPLC (K. Gwoździński) 370

12.2.3. Rozdział barwnikow roślinnych za pomocą kolumnowej chromatografii adsorpcyjnej (K. Gwoździński) 371

12.2.4. Rozdział substancji z wykorzystaniem chromatografii cienkowarstwowej (K. Gwoździński) 372

Literatura 373

13.1. Ogólne informacje o białkach (Z. Szweda-Lewandowska) 374

13. Biofizyka białek 374

13.2. Właściwości funkcjonalne i fizykochemiczne hemoglobiny 375

13.3. Ćwiczenia 378

13.3.1. Otrzymywanie i oznaczanie stężenia hemoglobiny (Z. Szweda-Lewandowska) 378

13.3.2. Oznaczanie krzywej dysocjacji tlenowej hemoglobiny metodą spektrofotometryczną (Z. Szweda-Lewandowska) 379

13.3.3. Efekt Bohra (Z. Szweda-Lewandowska) 381

13.3.4. Oznaczenie granicznej liczby lepkościowej [_] roztworów hemoglobiny natywnej i zdenaturowanej (Z. Szweda-Lewandowska) 382

13.3.5. Badanie stabilności methemoglobiny (Z. Szweda-Lewandowska) 385

13.3.5.1. Otrzymywanie methemoglobiny (Z. Szweda-Lewandowska) 385

13.3.5.2. Oznaczanie stabilności MetHb w środowisku kwaśnym oraz w obecności mocznika i chlorowodorku guanidyny (Z. Szweda-Lewandowska) 386

13.3.5.3. Oznaczenie szybkości denaturacji MetHb w moczniku i chlorowodorku guanidyny (Z. Szweda-Lewandowska) 386

13.3.5.4. Wyznaczanie energii aktywacji dla procesu denaturacji MetHb w środowisku kwaśnym (Z. Szweda-Lewandowska) 387

13.3.5.5. Wyznaczanie pK methemoglobiny (D. Pałecz) 388

13.4. Charakterystyka dysmutazy ponadtlenkowej (G. Zaleśna) 391

13.4.1. Izolowanie dysmutazy ponadtlenkowej z wątroby wieprzowej 391

13.4.2. Charakterystyka białka enzymatycznego 392

13.4.2.1. Oznaczanie białka 393

13.4.2.2. Metoda barwienia żeli na aktywność dysmutazy ponadtlenkowej 393

Literatura 394

13.4.2.3. Metoda pirogallolowa oznaczania aktywności dysmutazy ponadtlenkowej 394

14.1. Błony biologiczne (M. Bryszewska) 395

14. Biofizyka błon 395

14.1.1. Skład lipidowy błon 396

14.1.2. Asymetria lipidow błonowych 398

14.1.3. Oddziaływania międzycząsteczkowe 398

14.1.4. Płynność błony 399

14.1.5. Ruchy cząsteczkowe w dwuwarstwie lipidowej 400

14.1.6. Białka błonowe 402

14.1.7. Transport przez błony 404

14.2. Ćwiczenia 405

14.2.1. Wyznaczanie współczynnika przenikania (D. Pałecz) 405

14.2.2. Oporność osmotyczna erytrocytów (D. Pałecz) 407

14.2.3. Energia aktywacji procesu hemolizy (D. Pałecz) 411

14.2.3.1. Turbidymetryczny pomiar energii aktywacji procesu hemolizy 412

14.2.3.2. Absorpcjometryczny pomiar energii aktywacji procesu hemolizy 412

14.2.4. Izolowanie błon erytrocytarnych i charakterystyka chemiczna otrzymanego preparatu (A. Marczak) 413

14.2.4.1. Izolowanie błon erytrocytarnych 413

14.2.4.2. Ekstrakcja lipidow z błon erytrocytarnych (Vaskovsky i wsp., 1975) 414

14.2.4.3. Charakterystyka chemiczna otrzymanych błon erytrocytarnych 415

14.2.4.3.1. Oznaczanie zawartości białka 416

14.2.4.3.2. Oznaczenie zawartości hemoglobiny 416

14.2.4.3.3. Identyfikacja i oznaczanie ilościowe fosfolipidow błon erytrocytarnych 416

14.2.5. Otrzymywanie liposomów z lecytyny jaja kurzego i badanie ich przepuszczalności dla chromianu (D. Pałecz) 417

14.2.4.4. Opracowanie wyników 417

14.2.4.3.4. Oznaczanie zawartości cholesterolu 417

14.2.6. Wyznaczanie szybkości transportu 2,4-dinitrofenyloglutationu z erytrocytów człowieka (M. Soszyński) 419

Literatura 422

15.1. Powstawanie wolnych rodników (M. Gwoździński) 423

15. Wolne rodniki, antyutleniacze oraz uszkodzenia lipidów, białek i kwasów nukleinowych 423

15.2. Reakcje wolnych rodników (M. Gwoździński) 426

15.3. Wolne rodniki w biologii i medycynie (M. Gwoździński) 428

15.3.1. Powstawanie wolnych rodników in vivo 428

15.3.2. Udział czynników zewnętrznych w generowaniu aktywnych form tlenu 432

15.4. Komórkowe i tkankowe systemy ochronne przeciw aktywnym formom tlenu (M. Gwoździński) 437

15.5. Wolne rodniki w patologii (M. Gwoździński) 444

15.5.1. Utlenianie i modyfikacja lipidów 444

15.5.2. Utlenianie i modyfikacja białek 447

15.5.3. Utlenianie kwasów nukleinowych 451

15.6. Ćwiczenia 452

15.6.1. Oznaczanie stężenia zredukowanego glutationu w erytrocytach poddanych działaniu H2O2 (A. Marczak, K. Rękawiecka) 452

15.6.2. Oznaczanie rodników hydroksylowych HO• w układach biologicznych (Z. Szweda-Lewandowska) 454

15.6.2.1. Analiza degradacji deoksyrybozy przez układy generujące rodniki HO• 454

15.6.2.2. Oznaczanie stałych szybkości reakcji rodnikow HO• 456

15.6.3. Oznaczanie całkowitej zdolności antyoksydacyjnej płynów biogennych (G. Batrosz) 457

15.6.3.1. Oznaczanie całkowitej zdolności antyoksydacyjnej na zasadzie hamowania utleniania ABTS 458

15.6.3.2. Oznaczanie całkowitej zdolności antyoksydacyjnej na zasadzie hamowania utleniania 2',7'-dichlorofluorescyny 460

15.6.3.3. Oznaczanie całkowitej zdolności antyoksydacyjnej na zasadzie redukcji jonów żelazowych 460

15.6.3.4. Oznaczanie całkowitej zdolności antyoksydacyjnej na zasadzie redukcji kationorodnika ABTS + 461

15.6.4. Pułapkowanie spinowe (K. Gwoździński) 463

15.6.4.1. Pułapkowanie rodnika HO• przy użyciu DMPO 463

15.6.4.2. Pułapkowanie rodnika O2 –• przy użyciu DMPO 464

15.6.4.3. Pułapkowanie rodników O2 –• i HO• w pobudzonych neutrofilach 465

15.6.4.4. Pułapkowanie rodnika HO• przy użyciu PBN 466

Literatura 467

16.1. Apoptoza — wprowadzenie 468

16. Metody stosowane w badaniach apoptozy w komórkach (Z. Jóźwiak) 468

16.1.1. Rola białka p53 469

16.1.2. Rodzina białek Bcl-2 469

16.1.3. Struktura i funkcja kaspaz 471

16.1.4. Mechanizmy indukcji apoptozy 472

16.2. Ćwiczenia 474

16.2.1. Oznaczanie zmian apoptotycznych w komórkach za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego 474

16.2.2. Oznaczanie potencjału błony mitochondrialnej 476

16.2.3. Oznaczanie reaktywnych form tlenu w hodowlach komórkowych 479

16.2.4. Oznaczanie wewnątrzkomorkowego stężenia wapnia w fibroblastach 483

16.2.5. Oznaczanie aktywności kaspazy 3 w komórkach apoptotycznych 484

16.2.6. Oznaczanie uszkodzeń DNA metodą kometową 487

16.2.7. Oznaczanie fragmentacji DNA w żelu agarozowym 489

Literatura 492

17.1. Wprowadzenie 494

17. Cytometria przepływowa (J. Skierski) 494

17.2. Ćwiczenia 501

17.2.1. Utrwalanie komórek w alkoholu etylowym 501

17.2.2. Oznaczanie zawartości kwasów nukleinowych DNA i RNA przy użyciu barwienia oranżem akrydyny 502

17.2.3. Oznaczanie indeksu mitotycznego przy użyciu metody kwaśnej denaturacji DNA i barwienia oranżem akrydyny 506

17.2.4. Oznaczanie odsetka komórek żywych i martwych przy użyciu dioctanu fluoresceiny i jodku propidyny 509

17.2.5. Oznaczanie odsetka komórek apoptotycznych przy użyciu barwienia aneksyną V i jodkiem propidyny 512

17.2.6. Oznaczanie zawartości DNA i białek cytoplazmatycznych w komórkach po zabarwieniu DAPI i sulforodaminą 515

17.2.7. Wyznaczanie odsetka subpopulacji limfocytów przy użyciu zestawu przeciwciał monoklonalnych simultest firmy Becton-Dickinson 520

Literatura 525

18.1. Generowanie promieniowania laserowego (J. Kujawa) 526

18. Zastosowanie laserów w biologii i medycynie 526

18.2. Oddziaływanie promieniowania laserowego z tkanką biologiczną (J. Kujawa) 530

18.3. Ćwiczenia 533

18.3.1. Określanie stopnia hemolizy krwinek czerwonych poddawanych naświetlaniu promieniowaniem laserowym po inkubacji z ftalocyjaninami (E. Krajewska, D. Pałecz) 533

18.3.2. Pomiar aktywności acetylocholinoesterazy erytrocytarnej poddanej działaniu promieniowania laserowego (M. Sadowska) 535

Literatura 537

Tablice 539

Indeks 551