26
Rozdział20AnalizaDnA
gen
reakcjałańcuchowapolimerazy(Pcr)
Rys.2.2.Reakcjałańcuchowa
polimerazy(PCR)jestużywana
dotworzeniakopiiwybranych
segmentówcząsteczkiDnA0wtym
przykładziejestkopiowanyjedengen
DNAplazmidu
wstawianie
nowegoDnA
replikacjawewnątrz
wielekopiiDnA
bakterii
nowyDNA
koloniabakterii
Rys.2.3.KlonowanieDnA0
wtymprzykładziefragmentDnA
dosklonowaniawstawiasiędowektora
plazmidowego,którynastępnie
replikujesięwewnątrzkomórki
bakteryjnejgospodarza
MetodologiarekombinowaniaDNAdoprowadziładorozwojureakcjiłańcu-
chowejpolimerazy(PCR,ang.polymerasechainreaction).PCRjestniezwykle
prostątechniką-osiągasiędziękiniejjedyniepowtarzalnekopiowaniekrótkiej
cząsteczkiDNA(rys.2.2)-jednakokazałasięniezwykleistotnawwieludzie-
dzinachbadańbiologicznych,abadaniegenomówniejestostatnimznich.PCR
szczegółowoomówionowsekcji2.2.TechnikirekombinowaniaDNAleżątakże
upodstawyklonowaniaDNAlubklonowaniagenów,wktórymkrótkiefrag-
mentyDNAwstawiasiędoplazmidulubmateriaługenetycznegowirusairepli-
kujewbakteriachlubkomórkacheukariotycznych(rys.2.3).To,wjakisposób
przeprowadzasięklonowaniegenów,orazprzyczyny,dlaktórychtechnikatajest
ważnadlabadańgenomów,prześledzimywsekcji2.3.
2.1.ENZYMYSłUŻĄCEDOMANiPULACJiDNA
TechnologiarekombinowaniaDNAbyłajednymzgłównychczynnikówmają-
cychudziałwszybkimpostępiewiedzydotyczącejekspresjigenów,którynastąpił
wlatach70.i80.XXw.PodstawątechnologiirekombinowaniaDNAjestmożli-
wośćmanipulacjicząsteczkamiDNAwprobówce.Tozkoleizależyoddostępno-
ścioczyszczonychenzymówoznanychipoddającychsiękontroliaktywnościach,
któremożnazastosowaćdowprowadzeniaspecyficznychzmianwpoddawanych
manipulacjicząsteczkachDNA.Enzymydostępnedlabiologamolekularnego
należądoczterechszerokichkategorii:
•
polimerazyDNA,któresąenzymamisyntetyzującyminowepolinukleo-
tydykomplementarnedoistniejącejmatrycyDNAlubRNA(rys.2.4A),
•
nukleazy,któredegradującząsteczkiDNAprzezrozrywaniewiązańfosfo-
diestrowychłączącychjedennukleotydzdrugim(rys.2.4B),
•ligazy,którełączązesobącząsteczkiDNAprzezsyntezęwiązańfosfodie-
strowychmiędzynukleotydaminakońcachdwóchróżnychcząsteczeklub
nadwóchkońcachpojedynczejcząsteczki(rys.2.4C),
•
enzymymodyfikującekońce,którezmieniająkońcecząsteczekDNA
(rys.2.4D).
SposóbdziałaniapolimerazyDNAzależnejodmatrycy
WieletechnikużywanychdobadaniaDNAopierasięnasynteziekopiiDNA
całychlubczęściistniejącychcząsteczekDNAlubRNA.Jesttozasadniczewyma-
ganiedlareakcjiPCR(sekcja2.2),sekwencjonowaniaDNA(sekcje4.1i4.2)
iwieluinnychprocedurznajdującychsięwcentrumzainteresowaniabiologii
molekularnej.EnzymsyntetyzującyDNAnazywasiępolimeraząDNA,ataki,
którykopiujeistniejącącząsteczkęDNAlubRNA,nazywasiępolimeraząDNA
zależnąodmatrycy.PolimerazaDNAzależnaodmatrycytworzynowypoli-
nukleotydDNA,któregosekwencjajestnarzuconazgodniezregułamitworzenia
sięparzasadprzezsekwencjęnukleotydówkopiowanejcząsteczkiDNAlubRNA
(rys.2.5).Nowypolinukleotydjestzawszesyntetyzowanywkierunku5!→3!:
polimerazyDNAtworząceDNAwprzeciwnymkierunkuniesąznane
wnaturze.
WażnącechąsyntezyDNAzależnejodmatrycyjestto,żepolimerazaDNAjest
niezdolnadowykorzystaniajakomatrycycząsteczkicałkowiciejednoniciowej.
WcelurozpoczęciasyntezyDNAmusiistniećkrótkiobszardwuniciowy,by
dostarczyćkońca3!,doktóregoenzymdodanowenukleotydy(rys.2.6A).Wjaki
sposóbtowymaganiejestspełnianewżywychkomórkach,gdygenompodlega
replikacji,opisanowrozdziale15.WprobówcereakcjękopiowaniaDNArozpo-
czynasięprzezprzyłączeniedomatrycykrótkiegosyntetycznegooligonukleo-
tydu,zwykledługościok.20nukleotydów,którydziałajakostarterdosyntezy
DNA.Napierwszyrzutokapotrzebaistnieniastarteramożezdawaćsięniepo-
żądanąkomplikacjąwzastosowaniupolimerazDNAwtechnologiirekombino-
waniaDNA,aletrudnobardziejsięmylić.Ponieważprzyłączaniestarterado
matrycyzależyodtworzeniasięparzgodniezzasadamikomplementarności,
otym,wjakiejpozycjiwobrębiematrycyrozpoczniesiękopiowanieDNA,może