Treść książki
Przejdź do opcji czytnikaPrzejdź do nawigacjiPrzejdź do informacjiPrzejdź do stopki
14
AgnieszkaBachmura,AleksandraSztybor
–
wedługYuenT.iin.(2002),długośćamplikonuniepowinnaprzekraczać
200parnukleotydów,gdyżpowodujetoobniżeniewydajnościprzepro-
wadzanejreakcji.
Metodąwybarwiania,którąjestprojektowanedoświadczenie,nazywanajest
„sybrgreen”.JesttobardzopopularnametodawybarwieniacDNAwreakcjach
qPCR.SYBRjestzwiązkiemfluorescencyjnyminterkalującymdoDNA,przez
cojestużywanydooznaczaniailościDNAwbadanejpróbie.(Studzińskain.,
2008).
Doprzetestowaniadziałaniakolejnychnarzędziwykorzystanosekwencje
nukleotydowetrzechtranskryptóworganizmumodelowego-świnidomowej
(Susscrofaf.domestica):
–
dehydrogenazy17-beta-hydroksysteroidowejtypu8(numerakcesyjny
NationalCenterforBiotechnologyInformation-NM_001130730.1),
–
interleukiny15(numerakcesyjnyNCBI-NM_214390.1),
–
interferonowegoczynnikaregulacyjnego1(numerakcesyjnyNCBI-
NM_001097413.1).
DziękiżyczliwościKołaNaukowegoBiologiiMedycznejEXON,pozy-
skanosekwencjestarterówreferencyjnychwymienionychtranskryptów,które
zostaływykorzystanewbadaniachstosującychmetodęqPCRopublikowanych
wczasopismachnaukowychowysokimwspółczynnikuImpactFactor.Star-
teryzostaływybranenapodstawieopublikowanychwynikówbadań,które
świadczyłyoichsprawdzeniuprzezinnychautorów.Poprzeglądziedostępnej
literaturymamypewność,żesątosekwencje,któremogąbyćwykorzystywane
doamplifikowaniadanychfragmentówwinnychbadaniach.Wzwiązkuzczym
zdecydowałyśmysięznichkorzystać.
Dozaprojektowaniaparstarterównapodstawiewybranychsekwencjire-
ferencyjnychwykorzystanoprogramPrimer-BLAST(Ye2012).Zostałon
opracowanyprzezNCBIiumożliwia,międzyinnymi,wyszukiwaniesekwen-
cjipotencjalnychstarterówwmiejscachcharakterystycznychdlacząsteczek
mRNA,czylinapołączeniachegzon-ezgon.ZaletąnarzędziaPrimer-BLAST
jestsprzężeniezbazamidanychNucleotideiGenBankNCBI,którezkolei
gromadząiudostępniająwszystkiepublicznesekwencjeDNAwrazzadnotacją
bibliograficznąibiologiczną(Bensoniin.2000).Parametrydziałaniaprogramu
Primer-BLASTzestawiononaryc.1,2i3.Dodatkowonarzędzietopozwala
takżenauzyskiwaniepodstawowychinformacjiocechachfizykochemicznych
przewidzianychstarterów(ryc.4),takichjak:temperaturatopnienia(Tm),
długośćproduktu(Length),lokalizacja(StartiStop),procentowailośćzasad
guaninyicytozyny(GC%),atakżewspółczynnikkomplementarnościdotego
samegostarterawdwóchkierunkach(Selfcomplementarity).Bazadanych
