Treść książki
Przejdź do opcji czytnikaPrzejdź do nawigacjiPrzejdź do informacjiPrzejdź do stopki
Wektorysekwencyjne
Innymzastosowaniemwirusówwinżynieriigenetycznejjestużyciewektorówfagowych
dopoznaniasekwencjinukleotydowejanalizowanegoDNA(dosekwencjonowania).
PrzykłademwektorasekwencyjnegojestwektorutworzonyzwykorzystaniemDNA
fagaM13(rys.VI-1.3).Fagtennależydofilamentowych(podłużnych)fagówDNA,
okolistymjednoniciowymgenomie(ssDNA;ang.single-strandedDNA),którywnika
dokomórekbakteryjnych(zgatunkuEscherichiacoli)przezpiluspłciowy.Tam
powstajekomplementarnanićDNAiwiruspowielasięjakokolista,dwuniciowaforma
replikacyjna(formaRF;ang.replicationform),niezabijającgospodarza.Specyfika
sposobunamnażaniaDNAfagaM13(formyssDNAidsDNA)powoduje,żejeston
przydatnydotworzeniawektorówstosowanychdosekwencjonowaniaDNA
(rys.VI-1.2).WektortakistanowiformaRFgenomufagaM13,zmodyfikowanajedy-
niepoprzezdodaniepolilinkera.Wprowadzenietransgenuwobrębwektorapolegana
przecięciuobucząsteczektymsamymenzymemrestrykcyjnym,anastępniepołączeniu
takzlinearyzowanychcząsteczekzapomocąenzymuzwanegoligazą.Powstałahybry-
dowacząsteczkadsDNAjestnastępniewprowadzanadokomórekgospodarza,np.
wprocesietransformacji.Wewnątrzkomórkidochodzidojejnamnożeniawsposób
identycznyzprocesemnamnażaniagenomuwirusa.Wefekciepowstającząsteczki
hybrydowegossDNA.TakissDNApowyizolowaniuzkomórekipododaniupolime-
razyDNAorazodpowiedniegostartera(najczęściejkilkunastonukleotydowyssDNA
oznanejsekwencji)służyjakomatrycadosekwencjonowania.
101020Zastosowaniewirusów
Prezentacjabiałek
Technikaprezentacjibiałeknapowierzchnifagów(ang.phagedisplay)jestwydajną
metodąprzesiewowąstosowanąwbadaniachnadoddziaływaniamipomiędzybiałkami.
Zastosowanojąporazpierwszyw1985rokudoekspresjiantygenówwfaguM13.Róż-
norodnośćwektorówwykorzystywanychwmetodziephagedisplay(m.in.fagM13,T4,
T7,l)sprawia,żeznajdujeonaszerokiezastosowaniewposzukiwaniuiidentyfikacji
różnychbiałek,począwszyodkrótkichpeptydów,ażpofragmentyprzeciwciał,czyhor-
mony.Umiejscowieniebiałkanazewnątrzkapsyduumożliwiarównieżwykrycieicha-
rakterystykęligandów,czylicząsteczek,któreoddziałujązbadanymbiałkiem.
Obecnienajczęściejużywanymwektoremwomawianejtechnicejestbakteriofag
M13,infekującybakterieEscherichiacoli.FagM13jestfagiemtypufilamentowego
zgenomem(owielkości6407nukleotydów)wpostacikolistego,jednoniciowegoDNA
ododatniejpolarności[(+)ssDNA],otoczonegopłaszczembiałkowym.Płaszczjest
utworzonyzpięciubiałek:gpIII,gpVI,gpVII,gpVIIIigpIX,kodowanychprzez
genomfaga(rys.VI-1.3).
Określonesekwencjenukleotydoweklonujesięnajczęściejwobrębiedwóch
genów:genukodującegodrugorzędowebiałkopłaszcza(ang.minorprotein–gpIII)
lubgenugłównegobiałkapłaszcza(ang.majorprotein–gpVIII).BiałkogpIIIjestnaj-
większymbiałkiemkapsyduiwystępujewliczbiedo5kopiinajedenwirion,natomiast
białkogpVIIIwystępujenajliczniej–około2700jegokopiibudujekapsydjednej
7
