Treść książki

Przejdź do opcji czytnikaPrzejdź do nawigacjiPrzejdź do informacjiPrzejdź do stopki
12
1.Pozycjafilogenetycznabakteriiizasadyichtaksonomii
widentycznychwarunkach,analiząkontrolnąsyste-
muhomologicznego.Stopieńpodobieństwadwóch
różnychDNAobliczasięzewzoru:
Stwierdzono,żeorganizmywykazującewięcej
niż70%podobieństwazasadwDNAmogąbyćza-
liczonedojednegogatunku,awięcejniż20%-do
jednegorodzaju,mniejszewartościwskazująna
brakpokrewieństwa.
HybrydyzacjaDNA-DNAzwykorzystaniem
specyficznychsondmolekularnych
Jesttotechnikaprzydatnadoszybkiegowykry-
waniaokreślonychmikroorganizmówwpróbkach
materiałuklinicznegolubpobranychześrodowiska.
Jakosondamolekularnastosowanyjestfragment
DNAspecyficznydlainteresującejnasgrupymi-
kroorganizmów.Najczęściejjesttosyntetycznyoli-
gonukleotyd,zaprojektowanynapodstawieznajo-
mościsekwencjiwybranegogenumarkerowego,np.
kodującegoczynnikwirulencji.Takioligonukleotyd
zostajeodpowiedniowyznakowanyiwykorzystany
wreakcjihybrydyzacjiDNA-DNAtypuSouthern.
Jesttowięcformatypowaniamolekularnego,szcze-
gólnieprzydatnawsytuacji,gdynależyszybko
wykryćizidentyfikowaćbakterięchorobotwórczą
wmaterialepobranymodchorego,oczekującegona
rozpoczęcieleczenialubnapotwierdzeniediagnozy
iprawidłowościpodjętejterapii.
Wykorzystaniesondmolekularnychdoiden-
tyfikacjimikroorganizmu(aletakżenp.genu
wchromosomieorganizmueukariotycznego)me-
todąhybrydyzacjibezpośredniowbadanymma-
terialenazywamyzwyklehybrydyzacjąinsitu
(ISH,ang.insituhybridization).Jejodmianąjest
hybrydyzacjafluorescencyjnainsitu,tzw.techni-
kaFISH(ang.fluorescenceinsituhybridization),
gdziesondaoligonukleotydowajestwyznakowana
fluorescencyjnie,aidentyfikacjanastępujedzięki
stwierdzeniufluorescencjipowstałegohybrydu.
AnalizawzorówrestrykcyjnychDNA
Zastosowanieanalizyrestrykcyjnejdocelówiden-
tyfikacjiiklasyfikacjimikroorganizmówsprowa-
dzasiędoporównywaniawzorówrestrykcyjnych
ichgenomówzwykorzystaniemzasady,żewzór
restrykcyjnykażdejcząsteczkiDNAjestdlaniej
charakterystycznyipoprzezswojąunikatowość
charakteryzujetaksamo,jakodciskpalcacha-
rakteryzujekażdegoczłowieka.Dlategoteżwzór
restrykcyjnygenomowegoDNAmikroorganizmów
zostałnazwanyngenetycznymodciskiempalca
(ang.DNAfingerprint).Istniejewieletechnicznych
odmiantejmetody.
Woryginalnejmetodzie,nazywanejanalizą
polimorfizmudługościfragmentówrestrykcyjnych
DNA(RFLP,ang.restrictionfragmentlengthpo-
lymorphism),DNAgenomowydanegoszczepujest
ciętyokreślonymienzymamirestrykcyjnymi(s.372)
ipowstałeróżnejdługościfragmentyrestrykcyjne
rozdzielaneprzezelektroforezęwodpowiednim
żelu,aotrzymanywzórfragmentów(odciskDNA)
porównywanyzewzoreminnegoszczepu.Przybar-
dzodużejliczbiefragmentów(prążkówwżelu)pre-
cyzyjneporównaniewzorówrestrykcyjnychmoże
byćtrudnelubwręczniewykonalne.Jednymzroz-
wiązańtegoproblemujestzastosowanietzw.rzadko
tnącychendonukleazrestrykcyjnych,copowoduje
zmniejszenieliczbyfragmentów.
Alternatywnymrozwiązaniemjestwykorzysta-
nietechnikiRFLPdoanalizymniejszychregionów
DNA(zamplifikowanychwreakcjiPCR),obejmu-
jącychgeny,którezostałyokreślonemianemmar-
kerówmolekularnych,np.sekwencja16SrDNA
(przykładytakichmarkerówzostałyopisaneniżej).
AnalizywykorzystującetechnikęPCR
Łańcuchowareakcjapolimerazy(PCR,ang.poly-
merasechainreaction)zostałazastosowanawbiolo-
giimolekularnejporazpierwszywroku1983przez
K.Mullisa(uhonorowanegoNagrodąNoblawroku
1993).Obecniejestonastosowanazpowodzeniem
równieżwbadaniachklasyfikacyjno-taksonomicz-
nychorazwdiagnostyceklinicznejpodczastypo-
waniaszczepówbakteriipatogennych(np.metody
RAPD,MLST,AP-PCR,RT-PCR,MLVAitd.).
TechnikaPCRpozwalastwierdzić,czyintere-
sującanassekwencjajestobecnawanalizowanej
próbie.Jeżelitak,tostanowiącmatrycęwłańcu-
chowejreakcjipolimerazy,zzastosowaniemodpo-
wiednichstarterów,zostaniepowielona(zamplifi-
kowana).Uzyskanyproduktamplifikacji(fragment
dwuniciowegoDNAodługościodkilkudziesięciu
parzasaddokilkutysięcyparzasad)możebyćna-
stępniewróżnorakisposóbanalizowany.
Czynnikiem
decydującym
o
przynależno-
ścitaksonomicznejmożebyćobecność,braklub