Treść książki
Przejdź do opcji czytnikaPrzejdź do nawigacjiPrzejdź do informacjiPrzejdź do stopki
1.4.Metodyidentyfikacjiiklasyfikacjibakteriiiarcheonów
13
wielkośćdanegofragmentuDNA.Technikądia-
gnostycznąwykorzystującątakisystemklasyfi-
kacjijestnp.metodaMLVA(ang.multiple-locus
variablenumbertandemrepeatanalysis)umożli-
wiającatypowaniebakteriinapodstawiebadania
zmianliczbytandemowychpowtórzeń(VNTR,
ang.variablenumbertandemrepeats).Wmeto-
dzietejamplifikowanesąregionyzawierającepo-
wtórzenia,anastępniezzastosowaniemelektrofo-
rezykapilarnejszacowanajestdokładnawielkość
każdegoproduktuPCR.Znającwielkośćproduktu
amplifikacji,możnaoszacowaćliczbępowtórzeń
wkażdymzanalizowanychloci.Otrzymanein-
formacjetworząkodliczbowy,którymożebyć
łatwoporównanyzbaząreferencyjną.Metodata
jestzpowodzeniemstosowanapodczastypowania
bakteriipatogennych,np.Bacillusanthracis,Le-
gionellapneumophilaorazSalmonellaenterica.
InneanalizywykorzystującetechnikęPCRdo
identyfikacjiorganizmówprokariotycznychbazują
naporównaniuuzyskanegoproduktuamplifika-
cjizfragmentemwzorcowym,poprzeznp.anali-
zęrestrykcyjną(technikaRFLP).Alternatywnie
porównaniumogąpodlegaćkompletnesekwencje
nukleotydoweuzyskanychproduktówamplifikacji.
Napodstawieporównaniazamplifikowanychse-
kwencjinukleotydowychhomologicznychgenów
zkilkuorganizmów,określającpoziomichiden-
tycznościipodobieństwa,możemywnioskować
ostopniuichpokrewieństwa.Dlaanalizfilogene-
tycznychszczególnieprzydatnejestporównywanie
podobieństwasekwencjigenówkodującychrRNA
małejpodjednostkirybosomu(16SrRNAuproka-
riotówi18SrRNAueukariotów).
Analizyzwykorzystaniemmarkerów
molekularnych
Wchwiliobecnejuznajesię,żenajbardziejwia-
rygodnewynikidająanalizytaksonomiczne
ifilogenetycznebazującenapoznaniusekwencji
nukleotydowejgenówmarkerowych-tzw.identy-
fikacjamolekularna.Wśródpowszechniestosowa-
nychmarkerówmolekularnychnajczęściejwyko-
rzystujesięsekwencję16SrDNA,którakodujegen
16SrRNA,czyliskładnikmałejpodjednostkiry-
bosomuprokariotów.Cząsteczkataspełniapodsta-
wowewymogistawianemarkerommolekularnym
stosowanymwbadaniachfilogenetycznych,tj.:
.
występujewewszystkichznanychbakteriach
iarcheonach,
.
pełniwtychorganizmachrównoważnefunkcje,
.
zawierazarównosekwencjewwysokimstop-
niukonserwowane,jakisekwencjezmienne,
.
charakteryzujesiętempemzmiennościpropor-
cjonalnymdomierzonychdystansów(odległo-
ści)ewolucyjnych(tzn.niepodlegadrastycz-
nymiszybkimzmianommutacyjnym).
Sekwencjagenu16SrRNAobejmujefragment
DNAodługościokoło1500pz.Wjegoobrębie
wyróżniasię9regionówodużejzmienności(od-
powiednioV1-V9,ang.variableregions),które
mająkluczoweznaczniepodczasanalizfilogene-
tycznych.Pomiędzyregionamizmiennymiznaj-
dująsięobszaryDNAściślekonserwowane,które
wykorzystanodozaprojektowaniaodpowiednich
parstarterów.Opracowanezestawystarterówdo
PCRspecyficznedlabakteriiiarcheonówsąsto-
sowanedoamplifikacjiprawiecałegogenu16S
rRNA,aotrzymaneproduktyamplifikacjisąpod-
dawanesekwencjonowaniu.Ostatecznie,uzyskane
sekwencjenukleotydoweporównywanesązda-
nymizgromadzonymiwodpowiednichbazach
danych[np.RDP(RibosomalDatabaseProject)-
http://rdp.cme.msu.edu/orazNCBI(NationalCen-
terforBiotechnologyInformation)-http://www.
ncbi.nlm.nih.gov/)],copozwalazaklasyfikowaćor-
ganizmdodanejgrupytaksonomicznej(ryc.1.3).
Ryci1i3iSchemateksperymentumającegonaceluidentyfikacjęorganizmuprokariotycznego.(1)IzolacjaDNAzkomórek
bakteriilubarcheona.(2)AmplifikacjatechnikąPCRfragmentuDNAniosącegogenkodujący16SrRNA.(3)Sekwencjonowanie
produktuPCR.AnalizaotrzymanejsekwencjiDNA