Treść książki
Przejdź do opcji czytnikaPrzejdź do nawigacjiPrzejdź do informacjiPrzejdź do stopki
26
Proteomikaimetabolomika
nametodadoprzygotowaniazagęszczonychekstraktówbiałkowychdoblotingu
(technikiwesternblotting).NajczęściejtechnikatajestłączonazSDS-PAGE.
4.5.2.Technikiseparacji
Processeparacjimateriałubiologicznegozależyodjegonaturyipochodzenia.
Zwykleproceduraskładasięzkilkuetapów,zależnieodstopniazłożonościprób-
kiwejściowej.Wrazzprocesemdezintegracjikomórekzostająuwolnionetakie
związki,jak:sole,kwasynukleinowe,polisacharydy,lipidy,którezewzględuna
złożonośćbudowy,dużemasycząsteczkowe,czytworzeniekompleksówzbiał-
kamiutrudniająanalizęiidentyfikacjębiałek.Pomimorozwojuwielunowych
metodseparacji,jednąznajważniejszychnadalpozostajeelektroforezadwuwy-
miarowa(2-DE),wktórejzłożonemieszaninybiałeksąnajpierwrozdzielaneze
względunaróżnicepunktuizoelektrycznego(pI)–wprocesieogniskowaniaizo-
elektrycznego,anastępnie,zewzględunamasęcząsteczkową–podczaselektro-
forezywwarunkachdenaturujących(SDS-PAGE).
Technika2-DEmożestwarzaćproblemywstosowaniu,dlategoprzedwła-
ściwymrozdziałemopróczhomogenizacjiwykonujesięwstępnezabiegiprzy-
gotowawcze.Międzyinnyminależyusunąćsubstancje,któremogąinterfero-
waćzanalizowanąpróbkąipowodowaćnp.Hsmużenie”białek.Jednocześniena
każdymetapienależyumiejętniestosowaćodczynnikizapobiegającepowsta-
waniuniekorzystnychkompleksówzrozdzielanymibiałkamiorazmogącepo-
wodowaćnieodwracalnemodyfikacjebiałeklubobniżyćichrozpuszczalność.
Przykłademnajczęstszychmodyfikacjipowstającychwtrakcieprzygotowania
próbkisąm.in.:utlenianiemetioniny,formylacjawwynikudziałaniawiększych
stężeńkwasumrówkowego,proteoliza.Porozdzialeotrzymujesiędużąliczbę
białekmożliwychdobezpośredniejanalizyiidentyfikacjizapomocąspektro-
metriimas.
4.5.3.Procesrozpuszczaniabiałek
Niektórebiałkawyizolowanewformienatywnejsąsłaborozpuszczalne,dotyczy
tonp.białekbłonkomórkowych.Wzrostichrozpuszczalnościuzyskujesięstosu-
jącroztworyzawierającem.in.czynnikichaotropowe.Dodatkowowroztworach
tychznajdująsięczynnikiredukujące,którychzadaniemjestzerwaniemostków
disulifidowych,orazinhibitoryproteazchroniącebadanebiałkaprzedniespecy-
ficznymtrawieniem.
1.Czynnikichaotropowe–np.mocznik,tiomocznik.Związkitezapobiegają
tworzeniusięagregatówpoprzezzrywaniewiązańwodorowychioddziaływań
hydrofilowychzrozpuszczalnikiemwszystkichjonowychgrupaminokwasów
bocznych.Mocznikużywasięwdużychstężeniachod5do9M,niszczącskutecz-
niedrugorzędowąstrukturębiałek.Dodatkowaobecność2Mtiomocznikapo-
prawiawłaściwościsolwatacyjnebuforu,copotwierdzonoidentyfikacjąwiększej
liczbyplameknażelach2-DE.Jednocześnietiomocznikzmniejszarozpuszczal-
nośćmocznika,wzwiązkuzczymstężenietegoostatniegoniepowinnoprzekro-
czyć7M.Mocznikoraztiomocznikpodwpływemtemperaturyhydrolizujądo
pochodnychizocyjanianowych,któremogąmodyfikowaćbiałka.Ztegopowodu
