Treść książki
Przejdź do opcji czytnikaPrzejdź do nawigacjiPrzejdź do informacjiPrzejdź do stopki
28
Proteomikaimetabolomika
przedjegoanalizą,zazwyczajpoddajesiębiałkoprocesomredukcjiialkilacji
(utratawszystkichstrukturpozaI-rzędową)oraztrawieniuproteolityczne-
mu.Odmiennieprzedstawiasięproceduraizolacjiiidentyfikacjipojedynczych
białekklasycznymitechnikamibiochemicznymi.Wtymprzypadkumusimy
śledzićHnasze”białkowtrakcieizolacji,stosującselektywnąmetodędetekcji
(np.reakcjaenzymatyczna,metodyimmunologiczne,spektrofotometryczne/
fluorymetryczne,spektrometriamas).Najczęstszezanieczyszczeniamateriału
biologicznego,wywoływaneprzeznieskutkiorazprzykładowemetodyoczysz-
czaniazawieratabela4.2.
TABELA4.2.Najczęściejwystępującezanieczyszczeniamateriałubiologicznego
Rodzaj
zanieczyszczenia
Sole
Kwasy
nukleinowe
Polisacharydy
Lipidy
Proteinazy
Detergenty
Endogenne,małe
jony:nukleotydy,
fosfolipidy
Wywoływaneefekty
Uniemożliwiająanalizę
lubznaczniepogarszają
warunkichromatograficzne
ielektroforetyczne.
Dziękioddziaływaniom
elektrostatycznymtworzą
kompleksyzbiałkami,
osłabiająprocesogniskowania
izoelektrycznego,zatykająpory
żelu,dająsilnetłopodczas
wybarwianiasrebrem.
Kompleksysacharydów
zbiałkamipowodująpogorszenie
rozdziałuelektroforetycznego,
Hsmużenie”białek,zatykająpory
żelu.
Lipidyzmniejszają
rozpuszczalnośćbiałek,
wpływająnaichpI,zwiększają
znaczącomasę.
Degradująbiałkaipeptydy,przez
coutrudniająlubuniemożliwiają
analizę.
Tworząujemnienaładowane
kompleksyzbiałkami,
uniemożliwiająceogniskowanie
podczas2-DE.
Substancjeobecnewkażdym
lizaciekomórkowymsą
naładowaneiwpływająna
ogniskowanieizoelektryczne
białek.
Metodyoczyszczania
Dializa,sączeniemolekularne,
SPE,ultrafiltracja,
wytrącaniebiałekzroztworu
(rozpuszczalnikiorganiczne).
Wytrącaniekwasem
trichlorooctowym(TCA),
ultrawirowanielubtrawienie
mieszaninąnukleaz.
Wytrącaniekwasem
trichlorooctowym(TCA),
siarczanemamonuluboctanem
amonu.
Stosowaniedetergentów
(CHAPS)lubrozpuszczalników
organicznych(aceton,TCA/
aceton),zwłaszczawprzypadku
białekbłonowych.
Stosowanieinhibitorów
proteinaz:m.in.PMSF,TLCK,
EDTA,amastatyna,inaktywacja
wwysokiejtemperaturze,
inaktywacjamikrofalowa
Dializa,chromatografiażelowa,
chromatografiajonowymienna,
wytrącaniebiałekzroztworu,
chromatografiaoddziaływań
hydrofobowych.
Wytrącaniebiałekzapomocą
TCA/acetonu,zastosowanie
technikodsalających.
