Treść książki
Przejdź do opcji czytnikaPrzejdź do nawigacjiPrzejdź do informacjiPrzejdź do stopki
4.Przygotowaniemateriałubiologicznegodoanalizy
próbkizawierającezwiązkichaotropoweniemogąbyćogrzewanedotemperatu-
rywyższejniż37°C.
2.Detergenty–np.CHAPS,TritonX-100,sólsodowasiarczanudodecylu
(SDS),Tween20.
Stężeniedetergentuwzakresie1–4%powodujeusunięcieniekorzystnychod-
działywańhydrofobowych.Zewzględunacharakterczęścihydrofilowejdeter-
gentymożnapodzielićna3grupyzwiązków:
•jonowe–SDS,
•niejonowe–TritonX-100,NP-40,
•amfoteryczne–CHAPS,CHAPSO(3-[3-chloamidopropylo]dimetyloamo-
nio-2-hydroksy-1-propanosulfon),ASB-14(amidosulfobetaina-14).
Detergentyniejonowestosujesięwbadaniachnatywnychformbiałek.Wszyst-
kiewymienionewyżejzwiązkiorazamfolity(używanewtrakcieogniskowania
dopunktuizoelektrycznego)znaczącowpływająnaprocesanalizysubstancjiza
pomocąspektrometriimasizdecydowaniepogarszająwarunkianalizy.Ztego
względupowinnybyćwmiaręmożliwościusunięteprzedostatecznymetapem
identyfikacji.
3.Odczynnikiredukujące,np.ditiotreitol(DTT),1,4-ditioerytritol(DTE),
2-merkaptoetanol,tributylofosfina(TBP),tris(2-karboksyetylo)fosfina(TCEP).
Związkite,redukującmostkisiarczkowedogrupsulfhydylowych,ułatwiająroz-
fałdowaniebiałkaibardziejefektywnejegotrawienie.Corazczęściejstosujesię
pochodnefosfonowe,któreznaczącopoprawiająrozpuszczalnośćbiałekpodczas
procesuogniskowaniaizoelektrycznego.
Powstałewwynikuredukcjigrupysulfhydylowesąalkilowane,cozapobiega
oksydacjinowopowstałychgruptiolowych.Ponadtopoprawiatowydajnośćpro-
cesutrawienia.Związkaminajczęściejstosowanymidotegocelusąjodoacetamid
i2-winylopirydyna.
4.Inhibitoryproteaz.Naruszeniestrukturkomórkowychpowodujeuwolnie-
nieendogennychproteaz.Aktywnośćtychenzymówznaczniekomplikujeprofil
białkowy,dlategostosujesięinhibitoryproteaz,naogółwpostacigotowejmie-
szaniny(ang.inhibitorycocktail).Znajczęściejstosowanychinhibitorówmożna
wymienić:fluorekfenylometylosulfonowy(PMSF),fluorekaminoetylobenzy-
losulfonowy(AEBSF),ketonchlorometylowyN-tosylo-l-fenyloalaniny(TLCK),
benzamidynę,kwasetylenodiaminotetraoctowy(EDTA),amastatynę.Niektóre
ztychzwiązkówwykazujądużątoksyczność,dlategonależyjestosowaćzzacho-
waniemodpowiedniejostrożności.
27
4.6.Oczyszczaniebiałek
Wprocesiewydajnegooczyszczaniawykorzystujesięwłaściwościfizykoche-
micznebiałek,takiejak:ładunek,hydrofobowość,kształtcząsteczek,masa
molowairozpuszczalność.Dobrastrategiaoczyszczaniatotaka,którawsto-
sunkowokrótkimczasie,przydużejwydajnościi(ewentualnie)zachowaniu
aktywnościbiałka,prowadzidoefektywnegousunięciazanieczyszczających
składników.Wartozaznaczyć,żeidentyfikacjabiałkametodamiproteomiczny-
miniewymagazachowaniajegoaktywnościbiologicznej.Wręczprzeciwnie,
