Treść książki
Przejdź do opcji czytnikaPrzejdź do nawigacjiPrzejdź do informacjiPrzejdź do stopki
4.Przygotowaniemateriałubiologicznegodoanalizy
produktów,wszczególnościwykonanychzmateriałówsilikonowanych,które
niekiedyadsorbująniewielkieilościpróbki.Możnateżspodziewaćsięcharakte-
rystycznychsygnałównawidmiemasowym,pochodzącychodzanieczyszczeń
powstałychwprocesieprodukcyjnymprobówek.
25
4.5.Separacjaiizolacjabiałek
4.5.1.Lizakomórek
Wybórmetodypowinienbyćdostosowanydoilościirodzajupróbki.Pierwszym
etapempozyskiwaniabiałekjestlizakomóreklubdezintegracjatkanek.Najbar-
dziejpopularnymimetodamidezintegracjitkaneksą:homogenizacja,minerali-
zacja,wirowanie,sonifikacja,rozcieranie.Wśródnajczęściejstosowanychmetod
lizykomórekmożnawymienić:szokosmotyczny,homogenizacjawroztworze
powodującymlizę,metodanaprzemiennegozamrażaniairozmrażania.Zewzglę-
dunaobecnośćkwasów(np.HNO
3
),mineralizacjęstosujesięwyłączniewpo-
łączeniuzanaliząspecjacyjnąnp.pierwiastkówiniejesttometodaprzydatna
wanalizieproteomicznej.Wprzypadkulizykomórekprocedurajeststosunkowo
prosta.Hodowlekomórekprowadzisięwodpowiednichmediachhodowlanych
zdodatkiemwskaźnikapH(barwnika).Barwniktenskutecznieniszczykolumny
HPLC,częstowiążącsiętrwalezwypełnieniem(faząstacjonarną).Wzwiązku
ztym,przedrozpoczęciemizolacjinależyzastąpićmediumhodowlanebuforem
izotonicznym.
Mimożenadalnajchętniejstosujesięfizycznemetodydezintegracjitkanek,to
zewzględunałatwośćużycia,niskikosztidużąwydajnośćcorazczęściejwyko-
rzystujesięrównieżdetergenty.Zastosowaniedetergentówpowodujezwiększe-
nierozpuszczalnościbiałekwpróbceizerwanieoddziaływańmiędzylipidami
ibiałkami.Procedurytedotyczągłówniebiałekbłonowych.Najczęściejstoso-
wanymidetergentamisąsubstancjeniejonowe–TritonX-100(eterp-1,1,3,3-tetra-
metylobutylofenylpolietylenoglikolowy),NonidetP-40(NP-40,PEG-40nonylo-
fenyloeter,Tween80(polisorbinianmonoolejanu)iamfoteryczne–np.CHAPS
(3-[3-chloamidopropylo]dimetyloamonio-1-propanosulfonian).Detergentyjono-
wemogąpowodowaćdenaturacjębiałek,sązatemrzadziejstosowane,jednakże
cholanideoksycholansodu,jakosłabszezwiązkijonowe,sąodpowiedniedoeks-
trakcjibiałekwformienatywnej.Detergentywpływająjednakznacząconawy-
nikanalizywspektrometrzemasowym,powodującnajczęściejcałkowityzanik
sygnałówpochodzącychodskładnikówpróbki.Ztegowzględu,pozastosowaniu
detergentu,koniecznejestdokładneoczyszczenieanalizowanegomateriału.Nie
zawszejesttomożliwe,ponieważniektórebiałkawytrącająsięzroztworupozba-
wionegodetergentu.
Istniejerównieżbardzowydajnametodalizy,wktórejwykorzystujesięna-
przemiennezamrażanieirozmrażanietkanek(ang.freeze-thawlysis),przydatne
zwłaszczadoizolacjibiałekomałymstężeniu.Tkankęzanurzasięwroztworze,
poczymnaprzemienniekilkakrotniezamraża(np.wciekłymazocie,bądźweta-
noluzdodatkiemsuchegolodu),anastępnierozmraża.Podczaszamrażaniatwo-
rząsiękryształkilodu,którepowodująrozerwanietkanek.Jesttobardzoefektyw-
