Treść książki
Przejdź do opcji czytnikaPrzejdź do nawigacjiPrzejdź do informacjiPrzejdź do stopki
4.Przygotowaniemateriałubiologicznegodoanalizy
4.6.1.Zagęszczanie
Jakjużwspomniano,wielebiałekwystępujewukładachbiologicznychwbardzo
małychilościach.Niezwykleważnyjestwięcproceszagęszczania,gdyżumożli-
wiaidentyfikacjęsubstancjiomałymstężeniu,którebardzoczęstozawierająistot-
neinformacjediagnostyczneostaniekomórki.Wynikatozfaktu,żedetektory
stosowanewproteomiceimetabolomicesązależneodstężeniapróbkiwjedno-
stceobjętości(spektrofotometria,spektrometriamas),stądwysiłki,abymaksy-
malniezredukowaćobjętośćpróbki.Najprostszametoda–zagęszczaniepoprzez
odparowanienadmiarubuforu–jestbardzorzadkostosowana,zpowoduzwięk-
szającegosięjednocześniestężeniasoliorazzanieczyszczeń,wtyminnychbiałek.
Najczęściejstosujesięmetody,jak:wytrącanie,wysalanie,wirowanie,elektrofo-
reza,metodychromatograficzne,ekstrakcjadofazystałej,ultrawirowanie.
1.Wytrącanie–najczęściejużywanymiodczynnikamidowytrącaniabiałek
są:aceton,kwastrichlorooctowy(TCA),etanol,izopropanol,eterdietylowy,mie-
szanina:chloroform/metanol,aceton,siarczanamonuorazglikolpolietylenowy
(PEG).Bezwstępnycheksperymentówtrudnojestokreślić,którametodabędzie
optymalnawkonkretnymprzypadku.Wmieszaninachbiałekipeptydów,nie-
któreznichwytrącająsiębardziejefektywnie,np.wmieszaniniemetanoluzace-
tonem,ainnezkoleiwTCA.Jednakniedasięwtensposóbwytrącićwszystkich
składnikówpróbki.Jednymzrozwiązańmożebyćstosowaniewzorcówwe-
wnętrznych(np.deuterowanych)owłaściwościachpodobnychdogrupzwiąz-
kówznajdującychsięwpróbcelubkilkakrotnaanalizatejsamejpróbki,zzastoso-
waniemróżnychczynnikówstrącających.
2.Wirowanie–metodatapoleganazastosowaniuwirowaniaróżnicowego
lubnawirowaniuwgradienciegęstościroztworu.Pozwalatom.in.naskuteczne
rozdzielenieorganellikomórkowych.Metodętębardzoczęstostosujesiędoza-
gęszczaniabiałekbłonowychiwproteomiceorganelli.
3.Ultrawirowaniezwykorzystaniemselektywnieprzepuszczalnejmembra-
ny–dziękizastosowaniutejprostejmetodypróbkazostajezagęszczonaprzy
minimalnejutraciemateriału.Metodatapozwalarównieżnaodsoleniepróbki.
Anizotropowamembranacelulozowadziałajaksitomolekularne,przepuszcza-
jącpodczaswirowaniasubstancjeomasiecząsteczkowejmniejszejniżpodana
dladanejmembrany(cut-of)ipowodującprzeniesienieskładnikówomałejmasie
cząsteczkowej(np.soli)dodolnejczęścikoncentratora.Związkiowiększejmasie
cząsteczkowej(białka,kompleksy)zostajązatrzymanenamembranie.Wceluich
odzyskaniaprzeprowadzasiępowtórnewirowaniewprzeciwnymkierunkulub
odessanieroztworupozostałegonamembraniezapomocąnp.pipetyautoma-
tycznej.Parametrymembranynależytraktowaćwyłącznieorientacyjnie.Naprzy-
kładwwypadkualbuminyzawszeczęśćfrakcjiprzedostajesięprzezmembranę
nawetobardzomałychporach.
4.Elektroforeza–zarównojedno-,jakidwukierunkowaelektroforeza(1-DE
i2-DE)umożliwiająjednocześniezagęszczenieinteresującychnasbiałekorazana-
lizępoprzezrozdziałnażeluskładnikówpróbkizewzględunarozmiariładunek.
Technikielektroforetyczneopisanesądokładniejwrozdziałach6–9.
5.Metodychromatograficzne–szczególniewydajnymprocesemzagęszczania
białekjestchromatografiapowinowactwa.Zwykorzystaniemtejmetodyopraco-
29
