Treść książki
Przejdź do opcji czytnikaPrzejdź do nawigacjiPrzejdź do informacjiPrzejdź do stopki
RYC.1.1.8.Emisjafluorescencjiwtórnejprzez
trzyfluorochromydostarczonedożywych
ludzkichkomórekliniihMPC32Fwhodowli
invitro.Jądrakomórkowezostałyuwidocz-
nionewmikroskopiefluorescencyjnymdzięki
związaniuDNAzbarwnikiemDAPI(niebie-
ski),aparatendosomowykomórek(zielony)
emitujeświatłowzwiązkuznagromadzeniem
wpęcherzykachmonodansylkadaweryny,na-
tomiastlizosomylpóźneendosomyobserwuje
sięjakoefektemisjiczerwonejfluorescencji
wkwaśnymśrodowiskuorganelli.Skala:20Pm.
wzbudzającegodopreparatu,aświatłaemito-
pełniedenovo.Dziękiodkryciubiałekfluore-
wanegozpreparatudookularówbądźkamery.
scencyjnych(tj.białkazielonejfluorescencji;
Dziękiodpowiedniemuukładowiwspomnia-
Ing.greenfluorescentprotein),poznaniuich
nychwyżejelementówtłowmikroskopieflu-
sekwencjiaminokwasowejorazstrukturyczą-
orescencyjnymjestciemne,aświatłopocho-
steczkipowszechnestałosięmodyfikowanie
dziniemalwyłącznieodstrukturuprzednio
genetycznekomórekiorganizmów,wcelu
wyznakowanychfluorochromem(ryc.1.1.8).
ekspresjibiałekfluorescencyjnych.Wefek-
Mikroskopfluorescencyjnymaszerokie
ciebadaczemogąuwidocznićwmikroskopie
zastosowaniewbadaniachelementówkomór-
fluorescencyjnyminteresująceichstruktury
kowychznakowanychuprzedniowróżnyspo-
komórkowe(ryc.1.1.8).
sób.Wprzypadkująderkomórkowychstosuje
Mikroskopkonfokalny(współognisko-
sięfluorochromyodużympowinowactwiedo
wy)jestobecniepodstawowymnarzędziemdo
DNA(np.jodekpropidyny,DAPI),kwaśne
obserwacjistrukturbiologicznychznakowa-
środowiskolizosomówznakujesiębarwnika-
nychuprzedniofluorescencyjnie(ryc.1.1.9).
mifluoryzującymiintensywniewpHokoło5
Pierwszepodstawydoskonstruowaniamikro-
(np.oranżakrydyny),podczasgdymitochon-
skopukonfokalnegobyłyznanejużwlatach
driasązdolnedogromadzeniauprzednioutle-
pięćdziesiątychubiegłegowieku,aledopiero
nionychlubzredukowanychfluorochromów
rozwójtechnikikomputerowejpozwoliłna
(np.rezazuryna).Wysocespecyficznezna-
zrealizowaniewpełnifunkcjonalnegoskanu-
kowaniestrukturkomórkowychosiągasię
jącegolaserowegomikroskopukonfokalne-
zwykorzystaniemprzeciwciałsprzężonych
go(Ing.laserscanningconfocalmicroscope;
zfluorochromamiiskierowanychprzeciwko
LSCM)wpołowielatosiemdziesiątych.Obraz
charakterystycznemudlatejżestrukturyepi-
wytworzonyprzezmikroskopkonfokalnyjest
topowi(patrzrozdział1.3.3.Immunocytoche-
pozbawionyelementówpochodzącychspoza
mia,immunohistochemiaiimmunoznako-
ogniskowejobiektywu,coznaczącozwięk-
wanie).Obecniedostępnychjestkomercyjnie
szakontrastobrazówidziękitemuzdolność
wielefluorochromówsyntetyzowanychnaba-
rozdzielczą(ryc.1.1.7iryc.1.1.10).Odcięcie
ziecząsteczekfluoresceiny,rodaminyczyzu-
płaszczyznpozaogniskowychobiektywupod-
8
Podstawowetechnikibadawcze
