Treść książki
Przejdź do opcji czytnikaPrzejdź do nawigacjiPrzejdź do informacjiPrzejdź do stopki
2
Budowacząstekwirusów
2.1.Izolowanieioczyszczaniewirusów
Wirusyroślinbytująwewnątrzkomórekroślinnychizanimzaczniemypracęzmierzającąwkierunkupoznaniawirusaznalezionego
wjakiejśroślinie,musimytenwirusztejroślinywydostać,toznaczywyizolowaćgo.Zazwyczajmożnatozrobićjednymzdwóch
sposobów:1)rozdrobnićmateriałroślinnyzawierającywirus(liście,częścikwiatów,owoce,aczasemnawettakimateriałjakłyko)dotego
stopnia,byuzyskaćdośćpłynną,naokohomogennąpulpęzwaną„sokiem”,którazawierawirus;koniecznejestoczywiściezniszczenie
ściankomórkowych;2)znaleźćowadaczyinnyorganizmprzenoszącytenwirus,czylitzw.wektorawirusa(zob.podrozdz.6.6i6.7)
istworzyćsytuację,wktórejorganizmtenpobierzewirus.Następnietymsokiemalbozużyciemwektoratrzebazakazićjakąśodpowiednią
roślinę,którabędziesłużyćdoprowadzenia„hodowli”badanegowirusawlaboratorium.Wwyjątkowychprzypadkach,kiedywirusnie
przenosisięprzezsokaniprzezjakiegokolwiekwektora,możnasięuciecdoprzenoszeniaprzezszczepienie.Posługiwaniesięwczasie
badańroślinąstanowiącąoryginalneźródłowirusairosnącąwpolu,wsadzie,wogrodzieczywjakimśstanowiskunaturalnymjest
niewygodne(odległość)iniewskazane(niejesteśmywstaniekontrolowaćaniwarunkówwzrostutejrośliny,anistanujejzdrowotności,
amożeonateżbyćniewydajnymźródłemwirusa).Wieleinformacjinatematpostępowaniawtokuizolowaniawirusa,prowadzeniajego
kulturorazpóźniejszegooczyszczaniamożnaznaleźćwopracowaniachpomyślanychjakopraktikumwirusologiczne(np.Noordam,1973;
DijkstraideJager,1998;Kryczyński,2005b).
Oczywiście,kiedyprzystępujemydobadańtegowirusa,niewiemyonimprawieniciniewiemy,naprzykład,jakaroślinabędzie
odpowiedniadoprowadzeniajegohodowli.Częstotrzebawięcsprawdzićwieleróżnychroślinjakopotencjalnychżywicieliwirusa.Czasem
możemysięposłużyćtymsamymgatunkiem,naktórymwiruszostałznaleziony,czasemjakimśgatunkiempokrewnym.Czasem
wybieramyktóryśzgatunkówznanychjakodobrzyżywicielelicznychwirusówroślin.Dotakichroślinnależąróżnegatunkizrodzin
Solanaceae
,
Cucurbitaceae
czy
Fabaceae
.
Proceduryprzygotowaniasokuorazinokulacjimechanicznejroślinopisanoszczegółowowpodrozdziale6.4.Hodowlęwirusa
wlaboratorium,awłaściwiewszklarni,prowadzisięprzezkolejneprzenoszeniegomechanicznelubprzezodpowiedniewektorynanowe
egzemplarzeroślinstanowiącychdobrychżywicieliwirusaidobrejegoźródło.Oczywiście,roślinytemusząmiećzapewnioneodpowiednie
warunkiwzrostuirozwojuorazmusząbyćdobrzezabezpieczoneprzedniekontrolowanymzakażeniemprzezinnewirusylubinne
patogeny.Pasażującwielokrotniemechaniczniewirus,którywnaturzejestprzenoszonyprzezwektory,należysięliczyćzmożliwością
utratyzdolnościprzenoszeniagoprzeztewektory.Przezpewienczaskulturęwirusamożnautrzymaćwwysuszonymmaterialeroślinnym
umieszczonymweksykatorzenadchlorkiemwapniaalbowmaterialezamrożonym.Najlepszymsposobemprzechowywaniakultur
wirusówzapewniającymżywotnośćwirusomprzeznajdłuższyczasjestprzetrzymywaniewzliofilizowanejtkanceroślinnej.
Produktemrozdrabnianiamateriałuroślinnegowtokuizolowaniawirusazroślinyjesttzw.sok,czylizawiesinaróżnychfragmentów
komórekroślinnychiróżnychorganelliwroztworzerozpuszczalnychtreścikomórek.Cząstkiwirusawystępujątamwstaniewolnymalbo
sązwiązanezinnymiskładnikamitejzawiesiny.Oczyszczaniewirusa,czylidążeniedouzyskaniapreparatuwirusawmiaręmożliwości
wolnegoodzanieczyszczeń,ajednocześniezawierającegomożliwiedużąilośćwirusa,musiuwzględniaćjednązdwóchmożliwości:
1)próbujemyusunąćzzawiesinywszystkiejejskładnikiniebędącecząstkamiwirusaiwszystkiezwiązkirozpuszczalne,starającsię,byjak
największaliczbacząstekwirusapozostaławwodzielubwroztworzeoznanymskładzieiwłaściwościach;2)podejmujemypróbę
wytrąceniazzawiesinysamychcząstekwirusaisporządzamyznichczystązawiesinęwwodzielubroztworzeoznanymskładzie
iwłaściwościach.Wpraktyceproceduryoczyszczaniawirusówsąwieloetapoweinaposzczególnychetapachsąwykorzystywaneróżne
podejściairóżnemetody(Steere,1959,1964).
Jeślimamymożliwośćwyboru,dooczyszczaniapowinniśmywybraćszczep(izolat)wirusadobrzenamnażającysięiuzyskującywysoką
koncentracjęwroślinieźródłowej.Pożądanejest,bywybranyizolatwywoływałwyraźneobjawynadogodnejrośliniewskaźnikowej(zob.
podrozdz.8.4.2).Powinienbyćtakżestabilnychemicznieigenetycznie.Roślinaźródłowamusibyćwolnaodinnychwirusów.Powinnabyć
łatwawuprawieiłatwadoinokulacji.Niepowinnazawieraćinhibitorówwirusaaniciemnychbarwnikówiniepowinnamiećzbytdużo
tkankimechanicznej.Powinnabyćdobrymśrodowiskiemdonamnażaniawirusaizapewniaćjegowysoki„plon”wmożliwiekrótkim
czasie.
Wniektórychprzypadkachjużwczasieekstrakcjiwirusaztkankiroślinnejodpowiednimibuforamijestwskazanedodanieenzymów
pektolitycznychicelulolitycznychwceluułatwieniauwolnieniawirusaztkanki.Jesttoszczególniewskazanewprzypadkuwirusów
zlokalizowanychwefloemieistanowiącychbardzomałączęśćmasytkanki(TakanamiiKubo,1979).Zregułyekstrakcjęwirusastaramy
sięprzeprowadzićmieszaninąbuforówzrozpuszczalnikamiorganicznymi(butanol,pentanol,oktanol,chloroform).Emulsjatakałatwosię
rozwarstwia.Porozdzieleniufaz(np.przezwirowanieniskoobrotowe)różnefragmentykomórekroślinnychpozostająwfazie
rozpuszczalnikaorganicznego,awiruspozostajewzawiesiniewodnej.Zzawiesinytejmożnawytrącićwirusprzezwysalanienp.
siarczanem(VI)amonualboprzezdoprowadzeniepHśrodowiskadopunktuizoelektrycznegodlabiałkawirusa(np.przezzakwaszanie
kwasemoctowym).Wtychwarunkachwirusmożnastrącićprzezniskoobrotowewirowanie(do10tys.
g
).Niepożądanesubstancje
rozpuszczalnemożnausunąćprzezdializę.Dalszedoczyszczaniewirusamożnaprowadzićprzezwirowanienaprzemienne.Składasię
onozkilkucykliwirowanianaprzemianwzwykłej,niskoobrotowejwirówce(do10000
g
)iwultrawirówce(>30000
g
).Wczasie
wirowanianiskoobrotowegousuwamyresztkiwiększychzanieczyszczeń,awirowaniewultrawirówcepozwalastrącić(zatężyć)wirus.
Wirowaniewgradienciegęstości(ang.
densitygradientcentrifugation
)sacharozylubsolicezupozwalauzyskaćpreparatwirusa
odużejczystości.Wprobówcewirówkowejsporządzamyroztwórsacharozyomalejącychstężeniach(np.40,30,20i10%)alboroztwór
otzw.gradiencieliniowym,wktórymstężeniesacharozyzmieniasięstopniowokugórzeprobówkiod40do10%(zob.Noordam,1973).
Natakprzygotowanyroztwórnakładamypreparatwstępnieoczyszczonegowirusairozpoczynamywirowaniewrotorzeuchylnym(około
25000
g
),przyktórymprobówkauzyskujepozycjępoziomąwczasiewirowania.Nacząsteczkisacharozydziałasiłaodśrodkowa
przesuwającajewkierunkudnaprobówki,podczasgdyprzeciwdziałająjejsiłydyfuzji„wypychające”cząsteczkisacharozyzniżej
położonychwarstwgradientuowiększychstężeniachdowyższych,mniejgęstychstrefgradientu.Przydostateczniedługimwirowaniu
początkowygradient„schodkowy”automatyczniezmienisięwgradientliniowy.Niekiedyjednakwirowanieprzerywamyponp.dwóch
godzinach.Cząstkiwirusazawędrująwtymczasietakdalekowgłąbgradientu,jaknatopozwoląimprzeciwdziałającesobiesiły.Można
jeodzyskaćzestrefygradientu,wktórejsięznalazły.Jesttozwykłewirowaniewgradienciegęstości(ang.
rate-zonaldensitygradient
centrifugation
).Czasemjednakwirowaniekontynuujesiętakdługo(np.1dobę),ażroztwórznajdziesięwrównowadze,toznaczy
wytworzysięgradientliniowy,wktórymsiłaodśrodkowaniepozwolinadyfuzjęcząsteczeksacharozykustrefomomniejszymstężeniu,
aleniebędziejużwstanieprzemieścićdalszychcząsteczeksacharozydozbytzagęszczonychstrefgradientu.Cząstkiwirusaosiągną
pozycjęwgradiencie,wktórejichgęstośćbędzierównagęstościroztworu.Jesttotzw.równoważnewirowaniewgradienciegęstości(ang.
equilibriumdensitygradientcentrifugation
).Pozaprzestaniuwirowanianależyjaknajszybciejrozdzielićposzczególnestrefygradientu,
zanimwymieszająsięonewwynikuswobodnejdyfuzji.
SączeniemolekularnenakolumnachSephadeksulubagarozyczysefarozydoprowadzadorozdzielaniacząstekwzależnościodich
wielkości.Najszybciejprzezkolumnęprzeciekająnajwiększecząstki,któresązbytduże,bypenetrowaćgranulkiżeluiprzemieszczająsię
dośćszybkomiędzynimipodwpływemsiłyciężkości.Mniejszecząstkipenetrujągranulkiżeluwróżnymstopniu,cowpływanaszybkość
ichwędrówki.Pookreślonymczasiekolumnęprzemywasięodpowiedniodobranymrozpuszczalnikiemizbierakolejnefrakcjewypływające
zkolumny.
