Treść książki
Przejdź do opcji czytnikaPrzejdź do nawigacjiPrzejdź do informacjiPrzejdź do stopki
32
C–MIKROBIOLOGIA
komórekprzypadającychnastudzienkę,możnanastępnieotrzymaćliczbękomórek
wmlbadanejpróbki.Podobnąpodwzględemsamejkoncepcjimetodąjestcyto-
metriaprzepływowa,polegającanaelektronicznymzliczaniucząstekwmałejpróbce
poprzezprzepuszczaniewiązkilaseraprzezkapilaręoszerokościmniejwięcejjednej
komórki.
WostatnimczasiemetodytesąuzupełnianeprzeztechnikęilościowejPCR(qPCR).
Pozwalaonanaokreślenieliczbykopiipojedynczychgenów.Jeślinaprzykładudanam
sięokreślićliczbękopiigenu16SrRNAnaml,będziemymielipewnerozeznaniecodo
liczbybakterii.Choćmetodatamatrochęwad(niemamypewnościczygenomwszyst-
kichbakteriizawieratylkojednąkopiętego-lubjakiegokolwiekinnego-genu),dzięki
niejjesteśmywstaniewtymsamymczasieobliczaćstosunekliczebnościwieluróżnych
eukariotówiprokariotówpoprzezprzeprowadzanierównoległycheksperymentówna
tejsamejpróbce,zwykorzystaniemzestawówspecyficznychstarterów.Wskazówką,
czykomórkisążywe,czyuśpione,możebyćobecnośćATP
.Ogólnąaktywnośćpróbki
możnawięcoszacować,dokonując(chemicznego)pomiaruilościATP
.Podobnieteż
jedynieżywekomórkimogąprzeprowadzaćtranskrypcjęDNA,wobecczegodokonując
pomiarustężeniamRNA(RNAprzekaźnikowego)genówrybosomowychzapomocą
qPCRzodwrotnątranskrypcją,możnasprawdzić,ilekomórekjestżywych.Zakłada
się,żetranskryptytebędągromadzićsięwyłączniewaktywnychkomórkach.
Najczęściejstosowanąiwartościowąpoznawczometodąbadanialiczbyprokariotów
jestokreślanieliczbykomórekżywych.Zwyklerobisięto,stosującmetodęseryjnych
rozcieńczeń(ryc.2).Wtejmetodziewykorzystujesiępłytkiagarowe,awynikprzed-
stawiawpostaciliczbyjednostektworzącychkolonię(jtk)ml
-1
(angcfu-colony
formingunit).Niejesttowartośćrównoważnarzeczywistejliczbiekomórekżywych,
ponieważuwzględniatylkotegatunki,któreutworząwidocznekolonienadanym
podłożuiwdanychwarunkachinkubacji,wybranychnapotrzebyprzeprowadza-
negoeksperymentu.Liczbękomórekwwyjściowejpróbceustalasię,rozpoczynając
odpoliczeniakoloniinatejzpłytek,którazawieranajwiększąliczbęłatwodostrze-
galnychkolonii.Zazwyczajwartośćtawynosimniejniż200koloniinapłytkę,różni
sięjednakwzależnościodrozmiarukolonii.Ekwiwalentnąmetodąobliczanialiczby
prokariotów,którenierosnąnaagarze,jesttechnikanajbardziejprawdopodobnej
liczby,wramachktórejdooszacowanialiczbywpróbcewyjściowejsłużyposiew
różnychrozcieńczeńtejpróbkinapodłożepłynnewwielupowtórzeniach.
Jednymznajbardziejprecyzyjnychsposobówliczeniawszelkichmikroskopijnych
cząstekjestsortowaniekomóreknapodstawieichfluorescencji(FACS,ang.floures-
cence-activatedcellsorting).Możliwejestopracowaniebarwnikówfluorescencyjnych,
którebędąodmienniebarwićkomórkiżyweimartwe.Próbkawprowadzanajestdo
wąskiejkapilary,ośrednicyrównejzaledwieszerokościjednejkomórkiiprzechodzi
przezwiązkęlasera.Laserwzbudzabarwnikfluorescencyjnyiwzbudzenietoprze-
chodzidodetektora.Detektorpołączonyjestzbramkąpołożonątużponiżejlasera,
którypowłączeniuprzemieścikomórkędopojemnika.Komórkiniefluorescencyjne
