Treść książki

Przejdź do opcji czytnikaPrzejdź do nawigacjiPrzejdź do informacjiPrzejdź do stopki
1.4.Metodyidentyfikacjiiklasyfikacjibakteriiiarcheonów
11
Ponadtomogązostaćwykorzystanedoanalizy
różnorodnościfenotypowejmikroorganizmów.
AnalizakwasówtłuszczowychFAME
Cennychinformacjiprzydatnychdoklasyfikacji
prokariotówdostarczająbadanialipidów,szczegól-
nieokreślaniejakościowejiilościowejzawartości
kwasówtłuszczowychwbłoniecytoplazmatycznej,
aubakteriigramujemnychtakżewbłoniezewnętrz-
nej.Zewzględunawielkiezróżnicowaniestruktury
kwasówtłuszczowych(przejawiającesięróżnądłu-
gościąłańcuchawęglowego,obecnościąlubbrakiem
grupnienasyconychwpierścieniowychiliniowych
podstawnikach,obecnościągruphydroksylowych
itp.)analizaprofilukwasówtłuszczowychokreślo-
nychszczepówmożebyćważnącechądiagnostycz-
ną.Ogólnie,profiltakiotrzymujemywwynikueks-
trakcjikwasówtłuszczowychspośródwszystkich
lipidów(uzyskanychzkomórekhodowanychwwy-
standaryzowanychwarunkach)iichchemicznej
modyfikacji,prowadzącejdoutworzeniaestrówme-
tylowych,którejakozwiązkilotnemogąbyćiden-
tyfikowanezapomocąchromatografiigazowej.Wy-
nikpochodzącyzanalizynieznanegoszczepumoże
byćporównywanyzinformacjamizgromadzonymi
wodpowiedniejbaziedanych.Opisanatechnikana-
zywanajestanaliząFAME(ang.fattyacidmethyl
esther)imożebyćwykorzystywanawlaboratoriach
jakoelementidentyfikacjibakterii.Należyjednak
pamiętać,żewiarygodnośćwynikówwymagaści-
słejstandaryzacjiwarunkówzarównohodowli,jak
isamejanalizy.
1.4.2.AnalizyDNA
Najpowszechniejstosowaneobecniemetodyiden-
tyfikacjiiklasyfikacjiprokariotówopierająsięna
analizieDNA.Obecniestosowanemetodybazują
naróżnychtechnikachbiologiimolekularnej(np.
sekwencjonowaniuDNA),nadalwykorzystywa-
nejednakrównieżinne,nbardziejklasyczne”
metody.Analizaotrzymanychdanychumożliwia
wglądwfilogenetykędanejgrupymikroorgani-
zmówipozwalawnioskowaćnatematdrógich
ewolucji.
OznaczaniezawartościparG+C
ZawartośćparG+CwDNAprokariotówobejmuje
bardzoszerokizakres,odwartościokoło20%do
prawie80%.Parametrtenbyłelementemmolekular-
nejcharakterystykimikroorganizmównajwcześniej
zastosowanymwtaksonomii.ZawartośćG+Cjest
wyrażanajako:
ZastosowanieoznaczaniazawartościparG+C
wDNAbadanychorganizmówwtaksonomiima
ograniczoneznaczenie.Podczasgdyróżnewartości
zawartościG+Cświadcząobrakupokrewieństwa
badanychszczepów(różnicawiększaniż5%nie
pozwalazaliczyćszczepówdojednegogatunku),
towartościzbliżone,anawetidentyczneniemogą
byćjedynymkryteriumświadczącymoichpokre-
wieństwie,mogąbowiembyćprzypadkowe.Na
przykładzbliżonązawartośćG+Cmajątakodle-
głefilogenetycznierodzajebakterii,jakHelicobac-
ter(Epsilonproteobacteria):35-38%iRickettsia
(Alphaproteobacteria):29-33%.Zkoleiniektóre
rodzajecharakteryzujebardzodużyrozrzutza-
wartościG+CwDNAposzczególnychgatunków
(przykłademmożebyćrodzajBacillus32-69%lub
Clostridium21-54%).
NajdokładniejzawartośćG+CwDNAoblicza-
mybezpośredniozeznanejsekwencjinukleoty-
dowejDNA.Możnarównieżzastosowaćtechnikę
HPLC(ang.high-performanceliquidchromato-
graphy)(wysokosprawnachromatografiacieczowa)
pohydrolizieDNA.
HybrydyzacjaDNA:DNA
Technikatajeststosowanawodniesieniudocał-
kowitegoDNAzawartegowkomórceipozwalana
bezpośrednieporównywaniepodobieństwamiędzy
genomami.Pozwalaonastwierdzić,czypodobień-
stwopomiędzysekwencjaminukleotydowymige-
nomówjesttakduże,abymożliwebyłoutworze-
niemiędzynimiheterodupleksowychcząsteczek
DNA.Początkowodoanalizycząsteczekhetero-
dupleksowychwykorzystywanogłównietechnikę
mikroskopiielektronowej.Obecnieporównywane
cząsteczkiDNA,zktórychjednajestwyznako-
wana(np.radioizotopem32P,3Hlub14C).Preparaty
DNAdwóchbadanychszczepówdenaturujesięter-
micznie,następniemieszazesobąipowolischładza
wwarunkachumożliwiającychichrenaturację,czyli
odtworzeniedwuniciowychstrukturhybrydowych.
Kolejnyetaptopomiarpoziomuradioaktywności
cząsteczekhybrydowych.Technicznychwariantów
przeprowadzeniatakiegoeksperymentujestwiele.
Analizahybrydyzacyjnanieznanego(heterologicz-
nego)układumusibyćuzupełniona,przeprowadzoną