Treść książki

Przejdź do opcji czytnikaPrzejdź do nawigacjiPrzejdź do informacjiPrzejdź do stopki
26
10KwasynuklefinoweDNARNAļkluczedosyntezybfiałek
opóźniona
fragmenty
nić
okazaki
polimerazaDNA
3′
5′
(Polα)
wiodąca
nić
5′
3′
polimerazaDNA
ligazaDNA
IRNA(primer-DNA)
(Polδ)
helikaza
prymazaDNA
jednoniciowyDNA
białkowiążące
topolzomeraza
5′
3′
Rys.1.11.SchematreplikacjiDNA
IolimerazaDNA-TaTjestenzymem9którykatalizujesyntezęDNAwreakcji
PCR(PolymerazeChainReaction)-pozakomórkowejreplikacjiDNA>1.769
1.77].Wbiologiimolekularnejjestużywanatermostabilnapolimeraza-Taqizo-
lowanazbakteriiThermusaquaticus.Charakteryzujesięonawysokąstabilno-
ściąwszerokimzakresietemperatury35-950C.Optymalnejejdziałanienotuje
sięwtemperaturzeok.700C.
Obecnierzadkoużywasiępolimerazyizolowanejztermofilnychbakterii.
Wsprzedażygłówniepolimerazyotrzymanetechnikamiklonowaniawbak-
teriiE.coli.Polimerazyspecjalneznaprawąbłędów(proofreading)stosowa-
nedolong-rangePCRdosyntezydługichfragmentówDNApowyżej1500pz.
NajczęściejstosowanemodyfikowanepolimerazyHotStartEnzymzblo-
kadąjegocentrumaktywnego.Abynabraćwłaściwościenzymatycznych9za-
blokowanecentrummusibyćodblokowaneprzezogrzanieprzez15-20min
wtemperaturzeok.950C.Dziękitejmodyfikacjipolimerazadodawanadomie-
szaninyreakcyjnejjestnieaktywna.Dopierojejaktywacjajużwtermocyklerze
powoduje9żereakcjazaczynazachodzićwściślekontrolowanychwarunkach.
Ważnetojestszczególniepodczaspracyzwielomapróbkami9gdyistniejespo-
raróżnicaczasowapomiędzydodawaniemmateriałuzpierwszejiostatniej
próbki.ZastosowaniemodyfikowanejpolimerazytypuHotStartpowoduje9
żeniezależnieodliczbypróbekreakcjawkażdejzaczynasięwtymsamym
momencie.Otrzymujesięwtensposóbznacznieczystszyibardziejjednorodny
produkt.
Jednąznajnowocześniejszychgruppolimerazstanowiąenzymy9wktórych
centrumaktywnejestblokowaneprzeciwciałami9jakpolimerazaTeKaRa-
-TaTTMDNAIolimerase(dystrybutorBiocom).Wformienatywnejzablo-
kowaneprzeciwciałamicentrumaktywneenzymuuniemożliwiaprowadzenie