Treść książki
Przejdź do opcji czytnikaPrzejdź do nawigacjiPrzejdź do informacjiPrzejdź do stopki
1050ReplfikacjaDNA
27
reakcji.Podgrzanieenzymudotemperatury980Cprzez5-10spowodujedena-
turacjęprzeciwciałaiodblokowaniecentrumaktywnego.
Dobórodpowiedniegoenzymujestjednymzkluczowychetapówprojektowa-
niareakcjiPCR.
Replikacjajestprocesemendoergicznym9wymagającymdopływuenergii
niezbędnejdowytworzeniawiązaniafosfodiestrowegopomiędzyresztąkwasu
fosforowegoagrupą(-OH)cukrudeoksyrybozy.
Zastosowanieizotopu15Npozwoliłoeksperymentalnieudowodnićmechanizm
replikacjiDNA.Powtarzalnośćreplikacjijestbardzoduża.Błędniewstawiony
nukleotydpojawiasięwnowejniciśrednioraznamiliardnukleotydów.
IozakomórkowareplikacjaDNA(łańcuchowareakcjapolimerazy)
(PolymerazeChainReaction-PCR)tometodapowielaniaokreślonychfragmen-
tówDNAprzezjegosyntezęnajednołańcuchowychfragmentachrozwiniętej
helisyDNA.
ReakcjaPCRpozwalapowielićokreślony9unikalnyfragmentgenomupod
warunkiemznajomościjegosekwencji.
SkładnikiniezbędnedoprzebieguPCR>1.78].
-DNA9którejestmatrycądoreplikacji9wyizolowanązorganizmu(10-100ng);
-startery.krótkiejednoniciowefragmentyDNA(10-25bp)9któreinicjująreak-
cję;starteryprojektujesięnapodstawiesekwencji9którabędzieamplifikowana9
powinnyzawierać!50%zasadzGC;stężeniestarterówwynosi093-1ȝM;
-nukleotydy.ATP9GTP9CTP9TTP(stężeniekażdego200ȝM)9którestanowią
budulecdlanowopowstałegołańcuchaDNA;
-enzympolimerazaDNA-TaT.0975-1UTA4(Thermusaquaticus)lubTfl
(Thermusflavus)-termostabilnapolimerazaDNAprowadzącareplikację;
-buforpolimerazy.20mMsiarczanu(VI)amonu(NH4)2SO4i5mMkwasu
solnegoHCl9dostarczanyzpolimeraząjakoroztwór10-lub20-krotniestężony;
-kofaktorpolimerazy.195-290mMchlorkumagnezu(MgCl2);
-objętość.10-50ȝl9uzupełniasięwodądoostatecznejobjętości.
Metodatapoleganapowtarzaniucykliogrzewaniaioziębianiamieszaniny
reakcyjnejwcelumanipulowaniaprocesamizależnymiodtemperatury.
-denaturacjawtemp.940C(30-60s);
-przyłączeniestarterów30-700C(wzależnościodtemperaturytopnienia
starterów)(30-60s);
-elongacjaireplikacjaprowadzonaprzezenzympolimerazaDNAtemp.720C
(60-150swzależnościodmetody);
-końcowewydłużanie9powalającedosyntezowaćkońcowefragmentyDNA9
720Cprzez5-10min;
-pozostawieniepróbyposynteziewtemp.40C.
Obecniedotegocelustosujesiękomercyjneaparatytermocyklery.
