Treść książki
Przejdź do opcji czytnikaPrzejdź do nawigacjiPrzejdź do informacjiPrzejdź do stopki
1040SekwencjonowanfieDNA
19
1040SekwencjonowanfieDNA
Sekwencjonowanie(oznaczaniebudowyipołożenia-sekwencjifragmen-
tów)DNAjesttechnikąodczytywaniakolejnościparnukleotydowychwmakro-
cząsteczceDNA>1.64-1.71].MakrocząsteczkaDNAjestbardzoduża.Wcelu
określeniajejbudowytrzebająpodzielićnamniejszefragmenty.Celemsekwen-
cjonowaniaDNAjestustalenierodzajuikolejnościnukleotydówskładającychsię
nazapisinformacjigenetycznejwbadanejcząsteczceDNA.
Sekwencjonowaniemożnaprzeprowadzićróżnymimetodami9np.metodą
Sangera9metodąGilberta-Ma[ama9termicznegopirosekwencjonowania9bezpo-
średniegoodczytuczyelektroforezykapilarnej.
PrzebiegreakcjisekwencjonowaniametodąSangera>1.7091.71](patrz
podrozdz.1.4.1)jestopartynapozakomórkowejreplikacjiDNA9rozdziale
ioznaczeniuprzerwanychfragmentówDNAzapomocą.
-cienkowarstwowejchromatografiiżelowej(patrztomII9podrozdz.2.1.2);
-wysokorozdzielczejelektroforezykapilarnej(elektroforogram)(patrztomII9
podrozdz.3.1.6)>1.7291.73];
-detekcjispektroskopiifluorescencyjnej(patrztomII9podrozdz.4.6.4)9zna-
kowanychfluorescencyjnieprzerwanychfragmentów>1.7491.75]-każdemu
nukleozydowiodpowiadainnykolor.
Metodataumożliwiasekwencjonowanieautomatyczne.Niewymagadużo
materiaługenetycznego.W.GilbertorazF.Sangerotrzymaliw1980r.Nagrodę
NoblazaopracowaniemetodsekwencjonowaniaDNA.
MetodaGilberta±Ma[amapoleganaznakowaniupróbkiDNAnakońcuC-5V
radioizotopemfosforu32P>1.75].
Metodatermicznegopirosekwencjonowania-metodasekwencjonowania
DNAwczasierzeczywistym9którawykorzystujeanalizębłyskówchemiluminescen-
cjiemitowanychpodczasprzyłączaniakolejnoczterechnukleotydówenzymówdo
matrycyDNA.
-polimerazyDNA-TaT;
-sulfurylazyATI;
-lucyferazy;
-apirazy.
Metodabezpośredniegoodczytu(nanosekwencjonowania)9wktórejmakro-
cząsteczkaDNAprzesuwającasięprzezcentrumaktywnemodyfikowanych
polimerazjestodczytywanabezpośrednio.
Metodaelektroforezykapilarnej>1.7191.72]-odczytsekwencjiwmetodzie
Sangerazautomatyzowanydziękiwykorzystaniuznakowanychfluorescencyj-
nietrifosforanówdideoksynukleotydów9pozwalającynaodczyt300-1000par
zasadzjednejkapilary.
ObecniesekwencjonowanieDNAprzeprowadzasięzapomocązautomatyzo-
wanychaparatów.NowoczesneaparatydosekwencjonowaniaDNAsąwstanie
pracowaćzszybkościąrzędumilionówparzasaddziennie.
