Treść książki
Przejdź do opcji czytnikaPrzejdź do nawigacjiPrzejdź do informacjiPrzejdź do stopki
20
10KwasynuklefinoweDNAfiRNAļkluczedosyntezybfiałek
104010MetodaSangeratermfinacjfiwydłużanfiałańcucha
MetodaSangeraterminacjiwydłużania(elongation)łańcucha>1.6991.709
1.45]poleganawstępnymprzygotowaniumieszaninyreakcyjnejskładającejsięz.
-materiałuprzygotowanegodopowielenia(sekwencjonowania)(DNAmatrycowy)
(template);
-parystarterów(primers)9stanowiącychfragmentyDNA9któresąkomple-
mentarnedosekwencjiposzukiwanychodcinkówDNA;primerjestkrótkim
fragmentempojedynczegoDNAwiążącegosięzmatrycowymDNA(template)
idziałającymjakostarterpolimerazy;abyzaprojektowaćstarter9koniecznajest
znajomośćsekwencjiamplifikowanej;
-enzymutermostabilnejpolimerazyDNA-Taq;
-buforu.
Starterynajczęściejdobierasięnapodstawiedanychzamieszczonychwlitera-
turzeprzedmiotulubkonstruujesięnapodstawiesekwencjidostępnychwbanku
genów.
-czterechnukleotydów-dATP9dDTP9dTTP9dCTP(patrzpodrozdz.1.2);
-czterechterminującychdideoksynukleotydówDNA-trifosforanówdideoksy-
nukleozydówddNTI-ddATP9ddGTP9ddTTP9ddDCTP-wyznakowa-
nychróżnymibarwnikamiB1(dd-ATP-B1)9B2(dd-DTP-B2)9B3(dd-TTP-B3)9
B4(dd-DCTP-B4)9alewmniejszychilościachniżnukleotydy.
Startersyntezujeenzymprymaza9podczasgdyenzymegzonukleazausuwa
starteryzniciDNA.
Wprzypadkunieznajomościamplifikowanejsekwencjistosujesię10-15-nu-
kleotydowestarteryolosowychsekwencjach.Nadająsiędoanaliz.
-populacyjnych9
-ewolucyjnych9
-epidemiologicznych9
-mapowaniagenomów.
DideoksynukleotydyDNAsąpodobnedozwykłychnukleotydówDNA9
alebrakujeimgrupyhydroksylowej(-OH)naatomiewęglaC-3Vpierścienicu-
krowych9którejobecnośćumożliwiaładodanienowegonukleotydudoistnieją-
cegołańcucha.PododaniudołańcuchaDNAdideoksynukleotyduniemadostęp-
nejgrupyhydroksylowej(-OH)iniemogąbyćdodawanekolejnenukleotydy.
Łańcuchkończysiędideoksynukleotydem(ddNTP)9któryjestwyznakowany
określonymbarwnikiem(B)fluorescencyjnymwzależnościodzasady(A-B19
T-B29C-B3lubG-B4).
Mieszaninareakcyjnajestnastępniewkolejności.
-ogrzewanawceludenaturacjimatrycowegoDNA(rozdzieleniapodwójnejnici)
(denaturation);
-schładzana9abystartermógłzwiązaćsięzjednolicowąmatrycą(annealing);
-ponownieogrzewanapozwiązaniustartera9abyumożliwićpolimerazie
DNAsyntezęnowegoDNA9zaczynającodstartera;polimerazaDNAbędzie
