Treść książki
Przejdź do opcji czytnikaPrzejdź do nawigacjiPrzejdź do informacjiPrzejdź do stopki
1040SekwencjonowanfieDNA
21
kontynuowaćdodawaniedołańcuchaDNAnukleotydów(dATP9dDTP9dTTP9DTP)
wyznakowanychróżnymibarwnikami.B1(dd-ATP-B1)9B2(dd-DTP-B29
dd-TTP-B39dd-DCTP-B4zamiastnukleotydu(dATP9dDTP9dTTP9dCTP)
(elongation)9ażdochwili9gdyzostaniedodanydideoksynukleotyd(ddNTP);
wtymmomencieniejestjużmożliwedodawanieżadnychnukleotydów9więc
nićzakończysiędideoksynukleotydem(ddNTP)>1.7691.77].
PolimerazaDNAodbudowujenakażdejznicibrakujący9komplementarny
odcinekDNA9zaczynającodmiejscC-3V.Podczaspierwszegocykluzkażdego
jednoniciowegoodcinkaDNApowstajekolejnyfragment-liczbafragmentów
ulegapodwojeniu.Metodatapozwalanaotrzymaniewielufragmentówgenów
zniewielkiejilościmateriaługenetycznego.
104020MetodaGfilbertaļMa[ama
MetodaGilberta±Ma[amapoleganaznakowaniupróbkiDNAnakońcu
C-5Vradioizotopemfosforu32P9anastępnieichdegradacjiwczterechodrębnych
reakcjachwykorzystującychodmiennezestawyzwiązkówchemicznych>1.78].Na
pierwszymetapieprocesunastępujemodyfikacjazasadazotowychnukleotydów
ioderwanieichodresztcukrowychdeoksyrybozyłańcuchapolinukleotydu.
NadrugimetapiewmiejscachoderwaniazasadnićDNAulegacięciu.Wtym
celustosujesięreakcjewwymienionejkolejności.
-miejscecięciaG.siarczandimetylu(DMS)(CH3O)2SO2+piperydynaC5H11N
(metylacjaprzezDMS);
-miejscecięciaA+G.siarczandimetylu+piperydyna+kwasmrówkowy
HCOOH(depurynacjaprzezHCOOH);
-miejscecięciaC.hydrazyna(H2N-NH2)/chloreksodu(NaCl)9piperydyna
(hydrolizaprzezhydrazynęw195-molowymNaCl);
-miejscecięciaC+T.hydrazyna+piperydyna(hydrolizaprzezhydrazynę);
warunkirekcjidobranesąwtensposób9abyjednanićDNAuległaprzecięciu
na2-3fragmeny9zktórychjedenzawieraznacznikizotopowy.
PonieważdanazasadawystępujewłańcuchuDNAwielokrotnie9wmiesza-
ninieporeakcyjnejznajdujesięzbiórwielufragmentówDNAoróżnejdługości9
zależnejodmiejscacięcia.Fragmentyzczterechniezależnychreakcjirozdziela
sięelektroforetycznie9poczympoddajeautoradiografiiuwidaczniającejłańcuchy
DNAwyznakowaneizotopowo.UzyskaneprążkiodpowiadająfragmentomDNA
mającymnakońcuC-3Vokreślonązasadę.Wadątejmetodyjestdużatoksyczność
używanychodczynników.
Syntezęprowadzisięzwykorzystaniemtrifosforanówdideoksynukleozydów
(ddNTP9np.adenozynotrifosforanudATP)ienzymupolimerazyTaT9uzysku-
jącwtensposóbprzerwanefragmentyDNAoróżnejdługościzakończonespecy-
ficznymnukleotydem(chain-terminationnucleotyde).ATPprzyłączasię9tworząc
wiązanieestrowe9dowolnegokońcagrupyC-3V(-OH)doostatniejdeoksyrybozy
wnowoutworzonejniciDNA.Wytworzeniejednegowiązaniaestrowegomiędzy
