Treść książki
Przejdź do opcji czytnikaPrzejdź do nawigacjiPrzejdź do informacjiPrzejdź do stopki
Reakcjałańcuchowapolimerazy
19
Reakcjałańcuchowapolimerazy
Bogactwoinformacjizawartychwgenomiepozostajebezużytecznedlaekologówmo-
lekularnych,jeśliniemasiędonichdostępuijeśliniedasięichoszacować;stałosięto
możliweporoku1985,wdużejmierzedziękidr.Kary’emuMullisowi,któryopracował
metodępodnazwą„reakcjałańcuchowapolimerazy”,PCR(MullisiFaloona1987).
Jejwynalezienieokazałosięwielkimprzełomem,którypozwoliłbadaczomwyizolować
ipowielićokreślonyregionyDNAzdużychizłożonychgenomów.Trudnoprzecenić
znaczeniePCRdlawieludziedzinbiologii,cozresztądocenionow1993roku,kiedy
MullisotrzymałNagrodęNoblawdziedziniechemii.
PięknometodyPCRwynikazfaktu,żedziękiniejmożnazłatwościąpowielićjeden
lubwięcejregionówgenomu.Najczęściejprzebiegatotak,żenajpierwizolujesięcały
DNAzpróbki,anastępnieużywasięsparowanychprimerówoligonukleotydowych
wceluwielokrotnegopowieleniajednegolubwięcejdocelowychregionówDNA,dopóki
nieosiągniesięodpowiedniejliczbykopii.Primery,którychdługośćwynosizazwyczaj
od15do35parzasad,stanowiąniezbędnypunktpoczątkowysyntezyDNA,akażdy
znichmusibyćkomplementarnyzniciąDNAflankującądocelowąsekwencję,dzięki
czemuprzyłącząsiędożądanegomiejscaiustanowiąodpowiednipunktpoczątkowy
replikacji.
KażdycyklreakcjiPCRskładasięztrzechfaz:denaturacjiDNA,przyłączania
primerówiwydłużaniazsyntetyzowanychsekwencji(ryc.1.13).Fazapierwsza,de-
naturacjaDNA,poleganapodniesieniutemperaturydookoło94°C,dziękiczemu
wiązaniawodorowerozpadnąsię,adwuniciowyDNAstaniesięjednoniciowymDNA
matrycowym.Następnietemperaturaobniżanajestdo40–65°C,copozwalaprime-
romprzyłączyćsiędosekwencjikomplementarnychflankującychsekwencjędocelową.
Fazakońcowa,przebiegającazazwyczajwtemperaturze72°C,sprowadzasiędowyko-
rzystaniapolimerazyDNAorazwolnychnukleotydówużytychwreakcjidowydłuże-
niasekwencjiprimerów.Nukleotydysądodawanewuporządkowanysposób,poczy-
nającodkońcaprimeru3!,czylitak,jakprzebiegareplikacjaDNAinvivo(ryc.1.6).
WcykluPCRzkażdejmacierzystejniciDNApowstajądwienowenici,cosprawia,
żewprzebieguPCRliczbasekwencjirośniewykładniczo.NaproceduręPCRskłada
sięzazwyczaj35cykli,cowystarcza,byjednąsekwencjęmacierzystąpowielićdo68
miliardówkopii!
WPCRwykorzystujesiępolimerazętermostabilną,najczęściejpolimerazęTaq,
nazwanąwtensposób,ponieważzostaławyizolowanazbakteriiTermusaquaticus
bytującejwźródłachtermalnych.Wysokietemperaturyniedezaktywująpolimerazy
Taq,dziękiczemuwystarczydodaćjątylkoraz,napoczątkureakcji,któraprzebiega
wskomputeryzowanychtermocyklerach(urządzeniachdoPCR)przeprowadzających
cyklewróżnychtemperaturach.Wprzypadkuwykorzystywanianowychprimerówlub
analizyDNAróżnychgatunkówpotrzebnajestczasempewnaoptymalizacja,polegająca
naprzykładnamodyfikacjitemperaturyprzyłączaniaalbostężeniasoliwcelupodtrzy-
maniaaktywnościpolimerazy.Niemniejkiedyjużsiętegodokona,badaczmusijedynie
dostarczyćskładnikówreakcji,zaprogramowaćurządzenieiwrócićpojednej,dwóchlub
trzechgodzinach,kiedypracazostanieukończona.Potymczasieliczbakopiiregionu
