Treść książki
Przejdź do opcji czytnikaPrzejdź do nawigacjiPrzejdź do informacjiPrzejdź do stopki
Ilościowareakcjałańcuchowapolimerazy
21
końca.ReakcjeqPCRwykorzystujątesameelementycostandardowaPCR,zjednym
wyjątkiem:fragmentywytworzonewramachqPCRsąoznaczanebarwnikamifluore-
scencyjnymilubbarwnikamiwiążącymiDNAimogąbyćobliczanepokażdymcyklu.
DoreakcjiqPCRdodajesięwięcejprimerówipolimerazy,niżpotrzeba,wobecczego
jedynymczynnikiemwpływającymnaliczbękopiiDNAtworzonychwpoczątkowych
cyklachPCRjestilośćDNAmatrycowego;wynikastąd,żeilośćbarwnikadodanegodo
amplikonówjestwprostproporcjonalnadopoczątkowejilościDNA.Istniejezależność
międzypierwszymznaczącymwzrostemilościproduktuPCRacałkowitąilościąDNA
początkowego.MetodąqPCRmożnadokonywaćzarównowzględnej,jakibezwzględ-
nejocenyilościDNAlubRNA.Ocenabezwzględnadotyczyliczbykopiiuzyskanych
zokreślonejmatrycy;dokonujesięjejzazwyczaj,porównującilośćDNAwygenerowa-
nąwkażdymcykluzkrzywąwzorcowąopartąnapróbachoznanejjegozawartości
(ryc.1.14).Zkoleiocenawzględnapoleganaokreśleniu,którazpróbzawierawięcej,
aktóramniejdanegoproduktu.
MetodaqPCRmożeprzynieśćkorzyśćbadaniomekologicznymzwielupowo-
dów.Jednązjejzaletjestto,żepozwalabadaczomnaokreśleniewymaganejczułości
testów,tojestnasprawdzenie,ilemateriałuDNApowinnazawieraćpróbka,zanim
poddasięjąPCR.Brandliin.(2015)wykorzystaliqPCRdookreśleniaczułościte-
stówzukładupokarmowegowybranychgatunkówryb;chcieliustalić,wjakimstop-
niuteintrodukowanegatunkirybżywiąsięrybamirodzimymiwZatoceSanFranci-
sco.PozatymmetodęqPCRmożnawykorzystaćtakżedookreśleniaekspresjigenu:
ponieważtranskrypcjaRNAzachodzitylkowramachekspresjigenu,ilośćRNA
wpróbcewskazujenaintensywnośćzachodzącejekspresjigenu.Naukowcymogąwy-
izolowaćRNAzorganizmówipoddaćodwrotnejtranskrypcji(tj.przekształcićRNA
wDNA,cojestodwrotnościąprocesutranskrypcji),abypowstałwtensposóbDNA
komplementarny(cDNA).DziękioszacowaniucDNAmetodąqPCRmożliwejest
określeniestopnia,wjakimbadanygenpodlegałekspresjiworganizmiewmomencie
pobieraniapróbki.Możetopomócnaukowcompoznaćwarunkisprzyjającebądźto
regulacjidodatniej(podwyższonejekspresjigenu),bądźtoregulacjiujemnej(obni-
żonejekspresjigenu).MetodaqPCR,wktórejwykorzystanocDNA,posłużyłana-
ukowcomdooszacowaniaRNAwbadaniachnadkoralowcamiośmiopromiennymi.
Negatywnywpływnarafykoralowewywieradziałalnośćczłowiekaprowadzącado
podniesieniapHitemperaturyoceanów;Shimpiiin.(21016)wykorzystaliqPCRdo
porównaniapoziomówtranskrypcjizestawugenówreferencyjnych;chcielisprawdzić,
czyekspresjagenuzależyodśrodowiskowychczynnikówstresowych.Jednymzbada-
nychgenówbyłobiałkoszokucieplnego70(hsp70).Białkaszokucieplnego,zwane
równieżbiałkamistresu,sąwszechobecneiodgrywająwieleistotnychról,między
innymichroniąkomórkiprzedstresem;wprzypadkurodzajuSinulariawwyniku
wysokiegostresutermicznegoichekspresjasięzwiększała,agdypoziomstresuzwią-
zanyzodczynempHbyłniski–malała.Badanietopomogłolepiejzrozumieć,jak
koralowceodpowiadająnastres,atakżejakwprzyszłościbędąreagowaćnazmiany
czynnikówabiotycznych.
