Treść książki
Przejdź do opcji czytnikaPrzejdź do nawigacjiPrzejdź do informacjiPrzejdź do stopki
28
Rozdział1.Genetykamolekularnawekologii
Sekwencjonowaniedideoksyprzebiegawczterechseriachreakcji;wkażdejznich
udziałbiorąwszystkieczterynukleotydywpostacitrifosforanudeoksy(dNTP)inie-
wielkailośćjednegoznukleotydów(G,A,TlubC)wpostacitrifosforanudideoksy
(ddNTP).OstateczniektóryśzddNTPdołączysiędosekwencjiwkażdymmożliwym
miejscu,dziękiczemupowstanąfragmentyorozmiarachwpełnymzakresie–od1pzdo
maksymalnejdługościbadanejsekwencji.Wkażdejzseriireakcjibędąpowstawaćinne
rozmiaryfragmentów;wsekwencjonowaniumanualnymproduktykażdejztychreakcji
ulegnąrozmieszczeniunaosobnych,alesąsiadującychzesobąpasmachżelu.Fragmenty
temożnawizualizowaćnawielesposobów,wtymzapomocąwybarwianiasrebremczy
znacznikówradioaktywnych(izotopusiarkilubfosforu),którewykrywasięwproce-
sieautoradiografiinakliszachrentgenowskich.Rozmiaryfragmentówwdanympaśmie
odzwierciedlająmiejsca,wktórychpodczasdanejreakcjidołączyłsięddNTP.Naprzy-
kładjeśliwreakcji,wktórejudziałbrałdATPwpostacidideoksy,powstanąfragmenty
odługości1pz,5pzi10pz,znaczyto,żepierwszą,piątąidziesiątązasadąwsekwencji
musiałabyćadenina(A).Fragmentypochodzącezewszystkichczterechreakcjimożna
połączyćiodtworzyćsekwencjęwcałości.
Przezwielelatmanualnesekwencjonowaniedideoksybyłostandardem,obecniejed-
nakjestonowdużejmierzezastępowanesekwencjonowaniemautomatycznym.Naryn-
kudostępnychjestwielemodelisekwenatorówróżnychproducentów,alezasadywciążsą
takiesame.Różnefragmentyskładającesięnasekwencjenadalsągenerowanetaksamo,
jakopisanopowyżej,tyleżeobecnienukleotydyzawierającedideoksyrybozęsąznako-
waneróżnymibarwnikamifluorescencyjnymi.Ulepszenietosprawia,żereakcjinietrze-
baprzeprowadzaćjużoddzielnie,jakmiałotomiejscewprzypadkusekwencjonowania
manualnego,gdyżróżnekolorybarwnikaodpowiadająodmiennymrodzajomddNTP,
zasprawąktórychpowstałyfragmentyróżnejdługości.Gdyreakcjeprzeprowadzasię
wautomatycznychsekwenatorach,laserwzbudzabarwnikfluorescencyjnykażdegoprąż-
ka(zazwyczajjesttokolorczarnydlaG,zielonydlaA,czerwonydlaTiniebieskidla
C).Kolorjestnastępnierozpoznawanyprzezfotokomórkę,awplikukomputerowym
zostanązapisanedanedotyczącefragmentówwpostaciseriiróżnokolorowychszczytów.
Ponieważszczytowidanegokoloruodpowiadajednazzasad,całąsekwencjęmożnaod-
czytaćzpojedynczegoobrazu(ryc.1.17).
Sekwencjonowaniewysokoprzepustowe
Jakwspominaliśmy,jednymzgłównychmotorówrozwojuekologiimolekularnejjest
obecniecorazwiększadostępnośćsekwencjonowaniawysokoprzepustowego(HTS),
nazywanegoalternatywniesekwencjonowaniemnowejgeneracjilubmasowymse-
kwencjonowaniemrównoległym.Technologiataujrzałaświatłodziennemniejwięcej
wroku2005,aledoniedawnadysponowałyniąwyłączniewyspecjalizowanelaboratoria
zpokaźnymibudżetami;wciągukilkuostatnichlat,zuwaginajejszybkirozwójiopła-
calność,stałasięjednakdostępnaszerokiejspołecznościbadaczy.Mówiącnajogólniej,
metodaHTSpoleganajednoczesnymsekwencjonowaniumilionówcząsteczekDNA,
dziękiczemumożliwejestgenerowaniewiększejilościdanychsekwencyjnych,niżbyło
tomożliwewcześniej,anawetniżmożnatosobiebyłowyobrazić.HTStowrzeczywi-
stościterminparasolowy,obejmującywieletechnologii,którejednakłącządwagłówne
