Treść książki
Przejdź do opcji czytnikaPrzejdź do nawigacjiPrzejdź do informacjiPrzejdź do stopki
24
Rozdział1.Genetykamolekularnawekologii
wićproblemyzwiązanezamplifikacjąDNAzpróbekzdegradowanych,takichjakwłosy
czyodchody,ponieważpotrzebnesąwówczasalbodogłębnepotwierdzenie(naprzykład
przezwielokrotniegenotypowaniepojedynczejpróbki),albomodyfikacjestatystyczne
uwzględniającemożliwośćwystąpieniabłędówwgenotypowaniu(Knappiin.2009).
Jeślichodziosprawypraktyczne,przechowywaniepróbekpobranychwceluPCR
podczaspracwterenieniejestzbyttrudne,ponieważpróbkitemogąwystępować
wpostaciususzonychokazów(naprzykładpróbkiliściwkopertachzawierających
środkidopochłanianiawilgoci)albobyćprzetrzymywanewtemperaturzepokojowej
wniewielkichfiolkachz70–95-procentowymroztworemetanolulubroztworembu-
forowym.DNAwświeżopobranejkrwiczytkanceprzetrwawdobrymstanie,jeśli
tylkomateriałumieścisięwodpowiednimroztworzebuforowymlubetanolu–DNA
przechowywanynieprawidłowoulegniedegradacjiizamienisięwpofragmentowane
cząsteczki.DNAzpróbkinieżywej,takiejjakkałlubokazmuzealny,samwsobiebę-
dziejużzdegradowany.JeślifragmentyDNAzezdegradowanejpróbkibędąmniejsze
niżbadanyregionDNA,amplifikacjaPCRsięniepowiedzie;stądteżgdypracujesię
zpróbkamizdegradowanymi,przedmiotemanalizypowinnybyćstosunkowokrótkie
odcinkiDNA(ramka1.2).
MetodąPCRmożnaidentyfikowaćjednocześniewielegatunkóworganizmów,
posługującsięwtymcelupróbamizbiorczymi–technikętęzastosowanonapotrze-
bybadańnadwielomagrupamitaksonomicznymi,wtymżyjącymiwglebiegrzybami
(Schmidtiin.2013),schwytanymiwpułapkibezkręgowcami(Jiiin.2013)czyplankto-
nemwjeziorach(Poretskyiin.2014).eDNA,trzeciakategoria,toDNA,którytrafiłdo
środowiskawpostacirozkładającychsięciał,jakowydzieliny,krew,liście,pyłek,nasiona,
mocz,kał,skóralubinnymateriałpochodzącyodorganizmu.Większośćorganizmów
pozostawiawśrodowisku,wktórymsiępojawia,śladDNA,dlategotenmateriałmoże
byćdowodemobecnościkonkretnegoorganizmunadanymtereniewprzeszłościlub
obecnie;nietrzebawówczaszobaczyćgonawłasneoczy.Proszę,byczytelnikpodczas
lekturyzakładał,żeilekroćmowaoDNA,mamynamyśliDNAgenomowypobrany
zpojedynczychorganizmów,chybażezaznaczonoinaczej.ODNAzbiorczymieDNA
będziejeszczemowawrozdziale3.
PozyskiwaniedanychmetodąPCR
Rozmiarfragmentów
Określonyregiongenu,gdyzostaniejużpowielonyzodpowiedniejliczbypróbek,musi
byćwpewiensposóbopisany,takbynaukowiecbyłwstanieprzypisaćgenotypdokaż-
degoosobnika.Najprościejdokonaćtegonapodstawierozmiarupowielonegoproduktu,
któryjesteśmywstaniepoznać,rozdzielającproduktyPCRwżeluagarozowym.Roztwo-
ryżelusporządzasię,dodającdoroztworubuforowegoproszekagarozowy,anastępnie
podgrzewającroztwórdomomentu,ażstaniesiępłynny.Wówczasroztwórprzelewany
jestnatackęotoczonąusuwalnymiściankami,wyposażonąwgrzebienie,którezostająna
niej,dopókiroztwórnieschłodzisięiniezastygnie.Wtedygrzebieniesąusuwane,wwy-
nikuczegopojednejstronietworząsiękieszonki.Następnieusuwasięścianki,próbki
