Treść książki
Przejdź do opcji czytnikaPrzejdź do nawigacjiPrzejdź do informacjiPrzejdź do stopki
PozyskiwaniedanychmetodąPCR
27
Ryci1i16iRozdzielaniefragmentówDNAwżeluagarozowym.Ścieżki1–6todrabinkiwielkości–
zauważmy,żemniejszefragmentyprzemieszczająsięwżeluzwiększąprędkościąniżfragmenty
większychrozmiarów.Wścieżkach2i5uzyskanopojednymprążkuodługościniecoponad400pz.
Wpróbceześcieżki3znalazłysiędwaprążkiopodobnejdługościokoło200pz,zkoleiwścieżce
czwartejwykrytodwaprążkiodługościachokoło100iokoło300pz
Żelagarozowyumożliwiasprawdzenie,czywreakcjiPCRudałosiędokonaćamplifi-
kacjifragmentuDNAoczekiwanejdługości,jednakdoprecyzyjnegookreśleniarozmia-
ruprążkówtrzebawykorzystaćbardziejwyrafinowaneurządzenia,naprzykładtakie,
którychużywasiędopoznawaniawielkościallelimikrosatelitowych(rozdział2).Jeśli
powieloneproduktybędąróżnejdługości,będziemywstanienadaćimkonkretnątożsa-
mośćgenetyczną(zob.mikrosatelity,rozdział2).Jeżelijednak–azdarzasiętakczęsto–
sekwencjeoróżnymskładziebędątejsamejwielkości,doustaleniagenotypówtrzeba
będziezastosowaćsekwencjonowanieproduktówuzyskanychwramachPCR.
SekwencjonowanieDNA
PierwsząpowszechniewykorzystywanąmetodąsekwencjonowaniaDNAbyłotzw.
sekwencjonowaniedideoksyczyteżsekwencjonowanieSangera–technikaopracowa-
nawpołowielat70.XXwiekuprzezFrederickaSangera(tomiędzyinnymidzięki
temudokonaniunaukowiecotrzymałwroku1980NagrodęNobla).Polegaonana
syntezieniciDNAzużyciempolimerazyDNAipojedynczychnukleotydów,wczym
przypominaPCR–międzytymimetodamiistniejąjednakdwieznacząceróżnice.
Popierwsze,syntezęzapoczątkowujetylkojedenprimer,wzwiązkuzczymsekwen-
cjesądobudowywanewzdłużmatrycytylkowjednymkierunku.Podrugie,niektóre
nukleotydyzawierajądideoksyrybozę,aniedeoksyrybozę,czylicukierwystępujący
normalniewDNA.Cukiertenniemagrupy3!-hydroksylowejobecnejwdeoksyry-
bozie,wzwiązkuzczymniemożliwestajesiędodaniedotworzonejsekwencjiDNA
kolejnegonukleotydu;ilekroćzatemwreakcjiudziałweźmienukleotydzawierający
dideoksyrybozę,syntezadobiegakońca.
