Treść książki
Przejdź do opcji czytnikaPrzejdź do nawigacjiPrzejdź do informacjiPrzejdź do stopki
34
3.BadaniaGenetyCznewCHoRoBaCHmitoCHondRiaLnyCH
Wprzypadku,gdyistniejepotrzebaokreśleniapoziomuheteroplazmiilub
obawa,żewariantbędzieobecnynaniskimjejpoziomie,niesprawdzisięse-
kwencjonowaniemetodąSangera.CzułośćsekwencjonowaniametodąSangera
wwykrywaniuheteroplazmiioceniasięna15-20%,cooznacza,żewarianty
ojejniższympoziomie,atakimożebyćobecnywleukocytachkrwiobwodowej,
mogązostaćpominięteiuznanezatło.Równieżocenailościowaheteroplazmii
wprzypadkujejwyższegopoziomu,choćmożnająprzeprowadzić,niejestwiary-
godnazewzględunawielerundamplifikacjizarównopodczasprzygotowywania
matrycydosekwencjonowania(PCR),jakisamegosekwencjonowania.Lepsze
wynikidajetechnikaPCR-RFLP,któraprzyzastosowaniuznakowaniaizotopo-
wegowostatnimcykluPCRmożenawetpozwolićnawykrycieheteroplazmii
napoziomieponiżej10%,adlawyższychjejpoziomówdajewiarygodnewyniki.
Gdyjeststosowanabezznakowaniaradioizotopowego,pozwalanaoszacowanie
heteroplazmiiwłasnymokiem.Zuwaginajejniskikoszt,łatwośćzaprojekto-
waniaiprzeprowadzeniadobrzenadajesiędoweryfikacjiobecnościrzadkich
wariantówwróżnychtkankachpacjentaczyuczłonkówjegorodziny,czylibadań
naograniczonąskalę.
Jeżeliplanowanesąbadaniawiększejgrupyosóbwkierunkujakiegośwarian-
tuwrazzoznaczeniemheteroplazmii,wartozastosowaćmetodęopartąnaPCR
wczasierzeczywistym(Real-TimePCR).Pozwalaonanajednoczesnąanalizę
wielupróbibardzodokładneoznaczenieheteroplazmii.Wprzeliczeniunapróbę
niejestteżdroga,podwarunkiemanalizywielupróbjednocześnie.Jejustawie-
niemożebyćjednakczasochłonneipracochłonne,więcnienadajesięzbytdo-
brzedobadaniapojedynczychrodzinczyrzadkichwariantów.
CzęśćpatogennychwariantówmtDNAnatyleczęstostanowiprzyczynę
choroby,żewartojestprzeprowadzićupacjentatestysprawdzająceichobecność
przedzaplanowaniembadańnaszersząskalę.Jeślijednakokażesię,żebada-
niatakiedadząwynikujemny,azewzględunaobrazklinicznychorobylubod-
matczynedziedziczenieistniejeznaczneprawdopodobieństworzadkiejmutacji
mtDNA,wartoprzeprowadzićsekwencjonowaniecałegomitochondrialnego
DNA.MożnadotegoceluwykorzystaćmetodęSangera,jednakjestonapra-
co-iczasochłonna(mtDNAsekwencjonujesięwponaddwudziestufragmen-
tach)oraz,jakwcześniejwspomniano,niezbytdobrzenadajesiędooceny
heteroplazmii.Zamiastniejznacznielepiejzastosowaćsekwencjonowaniena-
stępnejgeneracji(sekwencjonowaniewysokoprzepustowe,NGS,next-generation
sequencing).Podczaspojedynczegosekwencjonowaniagenerowanesąsetkitysię-
cyodczytówdługości150-200parzasad.Sekwencjekolejnychodczytówprzy-
równanedosekwencjireferencyjnejzachodząnasiebie,akażdemiejscewgeno-
miemitochondrialnymjestodczytywanewielokrotnie(pokryciewynosićmoże
wieletysięcyrazy).Dziękitemuuzyskujesięnietylkodużądokładnośćbadania,
lecztakżeprecyzyjnąinformacjęoheteroplazmii(ryc.3.6).Wzależnościodliczby
