Treść książki
Przejdź do opcji czytnikaPrzejdź do nawigacjiPrzejdź do informacjiPrzejdź do stopki
28
Rozdział20AnalizaDnA
(A)SyntezaDNA5’
3’
5'
3'
starter
matryca
nowy
DNA
polimerazaDNA
5'
(b)Aktywnośćegzonukleazy3’
5'
3'
polimerazaodwraca
swójkierunek
5’
nieprawidłowy
nukleotyd
5'
(C)Aktywnośćegzonukleazy5’
3’
5'
3'
usuniętenukleotydy
5'
Rys.2.7.SyntezaDnAiaktywności
egzonukleolitycznepolimeraz
DnA0(A)AktywnośćsyntezyDnA
5!→3!umożliwiapolimerazie
dodawanienukleotydówdokońca3!
syntetyzowanejnici.(b)Aktywność
egzonukleazy3!→5!umożliwia
polimerazieusuwaniejednegolub
większejliczbynukleotydówzkońca
3!tworzonejnici.(c)Aktywność
egzonukleazy5!→3!umożliwia
polimerazieusuwaniejednego
lubwiększejliczbynukleotydów
zkońca5’polinukleotydu,któryjest
przyłączonydonicimatrycowej
3'
3'
fragmentnowegoDNA
ulegadegradacji
5'
5'
nowyDNA
aktywność
egzonukleazy5’
3'
3'
3’
5'
5'
Rys.2.8.Aktywnośćegzonukleazy
5ʹ→3ʹmożedegradowaćkoniec5ʹ
polinukleotydu,którywłaśniezostał
zsyntetyzowany
DrugąistotnącechąpolimerazDNAzależnychodmatrycyjestto,żewiele
znichtoenzymywielofunkcyjne,zdolnezarównododegradacjicząsteczek
DNA,jakiichsyntezy.Odzwierciedlato,wjakisposóbpolimerazyDNAdziałają
wkomórcewczasiereplikacjigenomu(sekcja15.3).Opróczzdolnościsyntezy
DNA5
!→
3
!
polimerazyDNAmogątakżemiećjednąlubobieaktywnościegzo-
nukleolityczne(rys.2.7).
•
Aktywność3ʹ→5ʹegzonukleazyumożliwiausuwanienukleotydów
zkońca3!świeżosyntetyzowanejnici.Nazywasiętoaktywnościąkorek-
cyjną,ponieważpozwalapolimeraziekorygowaćbłędyprzezusunięcie
omyłkowowstawionegonukleotydu.
•
Aktywność5ʹ→3ʹegzonukleazyjestmniejpowszechna,alewystępuje
wtychrodzajachpolimerazDNA,wktórychnaturalnafunkcjawreplikacji
genomuwymagazdolnościusuwaniaprzynajmniejczęścipolinukleotydu
jużprzyłączonegodonicimatrycowej,kopiowanejprzezpolimerazę.
TypypolimerazDNAstosowanewbadaniachnaukowych
KilkapolimerazDNAzależnychodmatrycystosowanychwbiologiimolekular-
nej(tab.2.1)jestwersjamipolimerazyDNAIEscherichiacoli,enzymu,który
odgrywagłównąrolęwreplikacjigenomutejbakterii(sekcja15.3).Enzymten,
czasemnazywanypolimeraząKornberga,odnazwiskajegoodkrywcyArthura
Kornberga,maobieaktywnościegzonukleolityczne3!→5!i5!→3!,coogranicza
jegoużytecznośćwmanipulowaniuDNA.Jegogłównymzastosowaniemjestsyn-
tezacząsteczekDNAzawierającychnukleotydyradioaktywnelubfluorescencyjne,
zwanaznakowaniemDNA.
Zdwóchaktywnościegzonukleolitycznychwersja5
!→
3
!
powodujewiększość
problemów,gdypolimerazaDNAjeststosowanadomanipulacjicząsteczkami
wprobówce.Dziejesiętak,ponieważenzymmającytęaktywnośćjestzdolnyusu-
waćnukleotydyzkońca5
!
polinukleotydu,którywłaśniezostałzsyntetyzowany
(rys.2.8).Małoprawdopodobne,żepolinukleotydulegniecałkowitejdegrada-
cji,ponieważaktywnośćpolimerazowazwykleznacznieprzewyższaaktywność
egzonukleolityczną,aleniektóretechnikiniebędądziałać,jeślikońce5
!
nowych
polipeptydówbędąskracanewjakikolwieksposób.Wszczególnościniektórestar-
szetechnikisekwencjonowaniaDNAopierająsięnasyntezienowychpolinukleo-
tydów,którewszystkiemajądokładnietakisamkoniec5!,oznaczonystarterem
zastosowanymdozainicjowaniareakcjisekwencjonowania.Jeślinastąpijakiekol-
wiek„obgryzanie”końców5
!
,niemożliwestaniesięustalenieprawidłowejsekwen-
cjiDNA.Właśniedlatego,gdyporazpierwszywprowadzonosekwencjonowanie
DNAwpóźnychlatach70.,wykorzystywałoonozmodyfikowanąwersjęenzymu
Kornberga,zwanąpolimeraząKlenowa.PolimerazęKlenowapierwotniewypre-
parowanoprzezcięcienaturalnegoenzymupolimerazyDNAIE.colinadwaseg-
mentyzużyciemproteazy.Jedenztychfragmentówzachowałaktywnośćpolime-
razyiegzonukleazy3
!→
5
!
,aleutraciłfunkcjęegzonukleazy5
!→
3
!
nietrawionego
enzymu.ObecnieenzymjestprawiezawszeizolowanyzkomórekE.coli,których
genpolimerazyzmodyfikowanotak,żeuzyskanyenzymmapożądanewłaściwości.
OptimumtemperaturyreakcjidlaenzymupolimerazyDNAIE.coliwynosi
370C,gdyżjesttotemperaturanaturalnegośrodowiskatejbakteriiwewnątrzjelit
ssaków,takichjakczłowiek.ReakcjewprobówkachzpolimerazamiKornberga
TABELA2010CECHYPOLiMERAZDnAZALEŻnYCHODMATRYCYUŻYWAnYCHWBADAniACHWBiOLOGii
MOLEKULARnEJ
Polimeraza
Opis
Głównezastosowanie
Szczegóły
PolimerazaDNAI
PolimerazaKlenowa
PolimerazaTaq
NiemodyfikowanyenzymE.coli
ZnakowanieDNA
Sekcja2.1
ZmodyfikowanawersjapolimerazyDNAIE.coli
ZnakowanieDNA
Sekcja2.1i4.1
PolimerazaDNAIThermusaquaticus
PCR
Sekcja2.2
Odwrotnatranskryptaza
PolimerazaDNAzależnaodRNA,otrzymywana
zróżnychretrowirusów
SyntezacDNA
Sekcja3.6i5.3
