Treść książki
Przejdź do opcji czytnikaPrzejdź do nawigacjiPrzejdź do informacjiPrzejdź do stopki
32
Rozdział20AnalizaDnA
studzienkanapróbkę
15minkapielw0,5μg·ml
roztworzebromkuetydyny
saneczki
przejrzyste
dlaUV
żel
agarozowy
-1
UV
UV
UV
prążki
uorescencji
DNA
Rys.2.12.PrążkiDnAwżelu
agarozowymuwidaczniasięprzez
barwieniebromkiemetydyny
%agarozy
0,5kb---
12kb---
5kb---
2kb---
1kb---
0,75
1,00
1,25
---12kb
---5kb
---2kb
---1kb
---0,5kb
Rys.2.13.Wielkośćfragmentów,
któremożnarozdzielić,zależyod
stężeniaagarozywżelu0elektroforezę
przeprowadzonowtrzechróżnych
stężeniachagarozy.oznaczonorozmiary
prążkówwlewymiprawympaśmie.
fot.dziękiuprzejmościbio-whittaker
MolecularApplications
cząsteczkisąsłabiejzatrzymywaneprzezpory,awięcwędrująprzezżelszybciejniż
cząsteczkidłuższe.Cząsteczkioróżnejwielkościtworząnażeluprążki(rys.2.11B).
Wbiologiimolekularnejużywasiędwóchrodzajówżelu:opisanegotutajżelu
agarozowegoiżelupoliakrylamidowego,głównieużywanegodosekwencjonowa-
niaDNA(sekcja4.1).Agarozatopolisacharydtworzącyżeleoporachosiągających
od100do300nmśrednicy;wielkośćzależyodstężeniaagarozywżelu.Stężenie
żeluokreślarozmiarfragmentówDNA,któremożnarozdzielić.Nazakresrozdzie-
laniamatakżewpływwartośćelektroendoosmotyczna(EEO)agarozy,tj.miara
liczbyzwiązanychanionówsiarczanowychipirogronianowych.ImwiększeEEO,
tymwolniejszetempomigracjiujemnienaładowanychcząsteczek,takichjakDNA.
Żelagarozowyprzygotowujesięprzezzmieszanieodpowiedniejilościaga-
rozywproszkuzbuforem,podgrzaniewcelurozpuszczeniaagarozyiwylanie
rozpuszczonejagarozynapłytkęzpleksiglasu,którąoklejasiętaśmą,abynie
przeciekała.Wżeluumieszczasięgrzebień,byutworzyćstudzienki(inaczejkie-
szonki)napróbki.Żelpozostawiasiędozastygnięcia,anastępnieprzeprowadza
sięelektroforezęwżeluzanurzonymwbuforze.Przednaniesieniemdopróbek
dodajesięjedenlubdwabarwnikioznanejszybkościmigracji,abymożnabyło
śledzićpostępelektroforezy.PrążkiDNAuwidaczniasięprzezzanurzenieżelu
wroztworzebromkuetydyny.ZwiązekteninterkalujemiędzyparyzasadDNA
ifluoryzujepoaktywacjipromieniowaniemultrafioletowym(rys.2.12).Niestety
proceduratajestryzykowna,gdyżbromeketydynyjestpotężnymmutagenem.
Wwielulaboratoriachwykorzystujesięwięcbarwnikiniemutagenne,barwiące
DNAnazielono,czerwonoczyniebiesko.Najbardziejczułebarwnikipozwalają
nawykrycieprążkówzawierającychmniejniż1ngDNA,wporównaniudo10ng
DNA,któremożnawykryć,wykorzystującbromeketydyny.
Zależnieodstężeniaagarozywżelupoelektroforeziemożnarozdzielićna
wyraźneprążkifragmentydługościod100bp(parzasad)do50tysięcyparzasad
(kilobaz,kb)(rys.2.13).Naprzykładżelogrubości0,5cmistężeniuagarozy
0,5%,którymawzględniedużepory,możnawykorzystaćdorozdziałucząste-
czek.Używasiędocząsteczek1-30kb,copozwalanp.narozróżnieniecząste-
czekowielkości10i12kb.Żelostężeniu0,3%możnawykorzystaćdocząsteczek
większych,do50kb,ażel5%docząsteczek100-500bp.
FragmentyDNAmożnaidentyfikowaćmetodąhybrydyzacjiSoutherna
GdywyjściowyDNAjeststosunkowokrótkącząsteczkąipotrawieniurestrykcyj-
nympowstajedwadzieścialubmniejfragmentów,zwykleudajesiędobraćtakie
stężenieagarozy,abykażdyfragmentbyłwidocznyjakosamodzielnyprążekna
żelu.JeśliwyjściowyDNAjestdługi,azatemdajewięcejfragmentówpotrawie-
niuenzymemrestrykcyjnym,toniezależnieodużytegostężeniaagarozynażelu
będziepoprostuwidaćsmugęDNA,ponieważwpróbcesąfragmentywszelkich
możliwychdługości,którychprążkisięzlewają.Takijestzwyklewynik,gdyenzy-
memrestrykcyjnymtrawisięDNAgenomowy.
JeśliznanajestsekwencjawyjściowegoDNA,tosekwencje,acozatymidzie-
rozmiaryfragmentówpowstałychwwynikutrawieniakonkretnymenzymem
restrykcyjnym-możnaprzewidzieć.Prążekzpożądanymfragmentem(np.zawie-
rającygen)możnawtedyzidentyfikować,wyciąćzżeluioczyścićDNA.Nawet
jeślinieznanyjestrozmiar,fragmentzawierającygenlubinnyinteresującyseg-
mentDNAmożnazidentyfikowaćzapomocątechnikizwanejhybrydyzacją
metodąSoutherna.Jedynymwarunkiemjestznajomośćlubmożliwośćprzewi-
dzeniachoćczęścisekwencjiwobrębieposzukiwanegogenulubfragmentuDNA.
Pierwszymetapemjestprzeniesieniefragmentówrestrykcyjnychzżeluagaro-
zowegonamembranęnylonowąlubnitrocelulozową.Przeprowadzasięto,kła-
dącmembranęnażeluiumożliwiającbuforowiprzesączaniesięiprzenoszenie
DNAzżelunamembranę,zktórąsięwiąże(rys.2.14A).Procestenprowadzido
unieruchomieniafragmentówDNAnapowierzchnimembranywtakichsamych
pozycjachwzględemsiebie.
Następnymetapemjestprzygotowaniesondydohybrydyzacjiwyznakowa-
nejcząsteczkiDNAosekwencjikomplementarnejdodocelowegoDNA,który
chcemywykryć.Doznakowaniaczęstowykorzystujesięznacznikpromienio-
twórczy.Możnasyntetyzowaćnukleotydy,wktórychjedenzatomówfosforu
