Treść książki

Przejdź do opcji czytnikaPrzejdź do nawigacjiPrzejdź do informacjiPrzejdź do stopki
2050201
Zabezpieczeniemateriałubiologicznego
nabadaniamolekularne0IzolacjaDNA
Należypamiętać,żebadaniamolekularnemogą
byćprzeprowadzonejedyniezapisemnązgodąoso-
by,którejdotyczą(wprzypadkudziecizgodęwyra-
żająrodzicelubprawniopiekunowiedziecka)izgodę
takąnależyuzyskaćprzedpobraniemmateriałubio-
logicznego.Dobadańmolekularnychmożnawyko-
rzystaćkażdyrodzajkomórekjądrzastych.Materia-
łembiologicznym,najczęściejwykorzystywanymdo
badańmolekularnych,jestkrewobwodowa.Doba-
dańmolekularnychpobierasięzazwyczajod1ml
(małedziecko)do5–10ml(osobadorosła)krwiob-
wodowej,alejeślibadaniewykonywanejestmetodą
PCR,wystarczyznaczniemniejkrwi,niekiedynawet
kilkaplamkrwinaspecjalnejbibule.Krewnależy
pobieraćnaEDTA,zazwyczajużywasiędotegocelu
firmowychprobówek,natomiastnienależyzastępo-
waćEDTAheparyną,ponieważhamujeonadziałanie
niektórychenzymówrestrykcyjnych.Niekiedybada-
niamolekularnewykonujesięnaDNAuzyskanym
zfragmentówkosmówki,zcebulekwłosowych,plam
krwi,bioptatówtkankowych,hodowliamniocytów
ifibroblastów,atakżezfragmentównarządówpobra-
nychwtrakciebadaniaanatomopatologicznegooraz
tkanekutrwalonychiprzechowywanychwpostaci
bloczkówparafinowych.Wszystkiepróbkimateriału
biologicznegoiwyizolowanyDNAmusząbyćdo-
kładnieopisane.JeśliizolacjaDNAniejestmożliwa
wciągu48godzinodpobrania,materiałbiologiczny
należyzamrozićwtemperaturze–200C.Bibułęzpla-
mamikrwitrzebazabezpieczyćprzedzanieczyszcze-
niem;możnaprzechowywaćwtemperaturzepoko-
jowej.
OpracowanokilkametodizolacjiDNA;zanajlep-
sząuważasięmetodęzzastosowaniemfenoluichlo-
roformu,opróczniejstosujesiętakżemetodęwysala-
niabiałekzlizatówkomórkowychorazizolacjęDNA
poprzezzwiązanieznośnikiem.PreparatDNAmoż-
naprzechowywaćnastępniewtemperaturze40C(kil-
kamiesięcy)lubwzamrożeniu(latami,jednaknależy
unikaćczęstegorozmrażaniaizamrażania).Preparat
DNAmożnateżprzesyłaćpocztą,wtemperaturze
pokojowej.
2050202
Strategiabadańmolekularnych
Strategiabadańmolekularnychmusizostaćstaran-
niedobrana,azależyonam.in.odrodzajumutacji
(np.delecjaczęścigenuczymutacjapunktowa)iod
tego,czymutacjalubmutacjeprowadzącedorozwo-
judanejchorobyznane,czyteżnieznaneiczywy-
stępująwściśleokreślonymmiejscu,czyteżmogą
występowaćwcałymdanymgenie.Niemożnapro-
wadzićdiagnostykimolekularnejwsposóbbezpo-
średniwprzypadkuchoróbgenetycznych,jeślinie
zostałznalezionykonkretnygen,któregomutacje
prowadządorozwojudanejchoroby(wokreślonych
warunkachmożnajedynieśledzićdziedziczeniezmu-
towanegogenuwrodzinie,obserwującprzekazywa-
niesprzężonegoznimmarkeramolekularnego).Spo-
śród20–25tysięcygenówczłowiekadotejporyoko-
ło1800zostałozbadanychnatyledobrze,że
występującewnichmutacjepowiązanozokreśloną
chorobą(chorobami)genetycznymi.Jeślijednak
spełnioneodpowiedniewarunki(przedewszyst-
kimdużerodziny,wktórychwystępujewieleosób
chorychnasamąchorobęgenetycznąmonogeno-
lubwieloczynnikowąorazwieleosóbzdrowych
ijestmożliwośćuzyskaniaodtychosóbmateriału
biologicznego),podejmujesięstarania,abyzidentyfi-
kowaćgen,któregomutacjeprzyczynąchoroby.
Powiększającwiedzęnatematpodłożamolekularne-
gochoróbjednogenowychiwieloczynnikowych
możnastworzyćzarazemmożliwośćdiagnostykimo-
lekularnejtejchoroby.
2050203
Hybrydyzacja
Hybrydyzacjapoleganatworzeniuhybrydu(du-
pleksu)międzysondąmolekularnąabadanymDNA.
Bezpośrednioprzedhybrydyzacjązarównosonda
molekularna,jakidocelowyDNAmuszązostaćzde-
naturowane,przezcochwilowonicipodwójnejspira-
liulegająrozdzieleniu.Hybrydyzacjajestmożliwa
dziękitemu,żekomplementarnesekwencjesondy
ibadanegoDNAodszukająsięnieomylnieipołączą,
jestzatemwysocespecyficzna.Sondamolekularna
jestznakowana(radioaktywnielubnieradioaktyw-
nie),bymogłabyćuwidocznionawmiejscuhybrydy-
zacji.
Istniejewielemetodopartychnahybrydyzacji
zsondąmolekularną.to:a)hybrydyzacjawroz-
tworze;b)hybrydyzacjanastałymnośnikuhybry-
dyzacjapunktowa(dotblot),hybrydyzacjametodą
Southerna,hybrydyzacjanorthern;c)hybrydyzacja
insitu.
GENETYKAWREUMATOLOGII47