Treść książki

Przejdź do opcji czytnikaPrzejdź do nawigacjiPrzejdź do informacjiPrzejdź do stopki
2050204
PCRijejmodyfikacje
morfizm.NastępnieproduktPCRmożenp.byćtra-
wionyodpowiedniodobranymenzymemrestrykcyj-
nym,poczymprowadzisięanalizędługościfrag-
mentówrestrykcyjnych(PCR-RFLP).Zamplifikowa-
Metodąszerokostosowanąwdiagnostycemoleku-
nyfragmentDNAmożezostaćwykorzystanytakże
larnejjestreakcjałańcuchowapolimerazy(PCR
dobadańprzesiewowych,takichjakanalizapolimor-
polymerasechainreaction).DoPCRpreparatDNA
fizmukonformacjijednoniciowychfragmentówDNA
musicharakteryzowaćsięszczególnączystością.
(PCR-SSCP),analizaheterodupleksów(PCR-HD),
PCRumożliwiaspecyficznąamplifikacjęinvitrowy-
analizaelektroforetycznawgradiencieczynnikade-
branegofragmentuDNAspośródcałkowitegogeno-
naturującego
(PCR-DGGE)
lub
wysokosprawna
mowegoDNA.Wielkośćamplifikowanegoodcinka
chromatografiacieczowazczynnikiemdenaturują-
wyznaczaodległośćmiędzydwomastarteramiflan-
cym(DHPLC).Niektóreztychmetodzostałyomó-
kującymiodcinekDNAmającyulecamplifikacji.
wioneponiżej.
Specyficznośćreakcjijestutrzymanadziękitemu,że
starterykomplementarnedoamplifikowanegood-
cinkaDNA.Starterymajądługość18–28nukleoty-
2050205
dów.AmplifikacjametodąPCRpoleganapowtarza-
niucykli:denaturacjimatrycowegoDNA,podczas
RFLP
którejDNAulegarozdzieleniu,umożliwiającdostęp
starterom,orazspecyficznegowiązaniastarterów
Wmetodzietejstosowaneenzymyrestrykcyj-
isyntezykomplementarnejniciDNAprzeprowadza-
ne,którerozpoznająspecyficznedlasiebiesekwencje
nejprzeztermostabilnąpolimerazę.Wkażdymcyklu
DNAiprzecinająnićDNAwokreślonychmiejscach.
dochodzizatemdopodwojeniawyjściowejliczby
Polimorfizmdługościfragmentówrestrykcyjnych
matryc.Wtrakcie30cykliwybranasekwencjaDNA
(RFLPrestrictionfragmentlengthpolymorphism)
ulegaamplifikacjiponadmilionrazy.Ważnązaletą
jestmetodąszerokowykorzystywanąwdiagnostyce
PCRjestfakt,żedobadańwystarczabardzomała
molekularnej.Metodatamożesłużyćdowykrywania
ilośćmateriałubiologicznego.Matoszczególnezna-
mutacji,jeślidochodzidousunięciadotychczasowe-
czenienp.przydiagnostycepreimplantacyjnej,kiedy
golubwprowadzenianowegomiejscacięciaenzy-
dodiagnostykimusiwystarczyćpojedynczakomór-
memrestrykcyjnym.
ka.OgraniczeniemwPCRjestnatomiastto,żemusi
Wdiagnostycemolekularnejdążysiędowykrycia
byćznanasekwencjafragmentuDNAmającegoulec
mutacjiprowadzącejdodanejchorobyuwarunkowa-
amplifikacji,chociażniedogodnośćmożnaczęścio-
nejjednogenowo,alewwieluprzypadkachbadasię
woobejść.
takżepolimorfizmy(bardzoważnewprzypadkuba-
ProduktyPCRmożnaodrazupoddawaćelektro-
daniachoróbuwarunkowanychwieloczynnikowo).
foreziewżelachagarozowychlubpoliakryloamido-
PolimorfizmyRFLPwariantamisekwencjiDNA,
wychiuwidocznićbromkiemetydyny,srebrzeniem
wktórychdochodzidoutworzeniaalbozanikumiej-
azotanemsrebralubwprzypadkusondznakowa-
scarozpoznawanegoprzezenzymyrestrykcyjnelub
nychizotopamiradioaktywnymilubfluorochromami
różniącymisięliczbąnukleotydówmiędzymiejscami
zastosowaćodpowiednioautoradiografięalbo
cięciaprzezdanyenzymrestrykcyjny.Polimorfizmy
fluorografię.Bezpośrednierozróżnieniealleluprawi-
DNAprzekazywanezpokolenianapokoleniejako
dłowego(dzikiego)odalleluzmutowanegoumożli-
cechykodominujące.
wiaASA-PCR(dziękiodpowiedniodobranymstarte-
rom)orazPCR-ASO(dziękiodpowiedniodobranym
sondomoligonukleotydowym).
2050206
PCRmultipleks,wktórejjestamplifikowanychjed-
Wniektórychprzypadkachstosujesięmetodę
SSCP
nocześniekilkafragmentówDNA.
KonwencjonalnaPCRtometodajakościowa
Polimorfizmkonformacjijednoniciowychfrag-
ilośćzamplifikowanegoDNAzależyodliczbycy-
mentówDNA(SSCPsinglestrandconformation
kli,alenieodliczbykopiibadanegofragmentuDNA.
polymorphism)jestbadaniemprzesiewowym,po-
Dlailościowegopomiaruliczbykopiigenuwgeno-
zwalającymnaidentyfikacjęfragmentówDNA,
mowymDNAopracowanoPCRwczasierzeczywi-
wktórychwystępująmutacjalubpolimorfizm.Po
stym(real-timePCR).
amplifikacjifragmentówDNAmetodąPCRdenatu-
CzęstoPCRjestdopierowstępemdodalszychba-
rowaneonetermiczniewbuforzeobciążającym,
dańwówczassłużydoamplifikacjifragmentu
zawierającymformamidlubinnyskładnikdenaturu-
DNA,wktórymmożewystępowaćmutacjalubpoli-
jący,następnienakładasięnażelpoliakryloamidowy
48