Treść książki

Przejdź do opcji czytnikaPrzejdź do nawigacjiPrzejdź do informacjiPrzejdź do stopki
iprowadzirozdziałelektroforetyczny.Wtrakcieelek-
troforezypowstająwewnętrznesparowanianici
DNA,prowadzącdowytworzeniaokreślonejkonfor-
macjiprzestrzennej.FragmentDNA,wktórymwy-
stępująmutacjalubpolimorfizm,migrujeinaczej,za-
temostatecznieobserwujemyzmienionywzórprąż-
kówSSCP.Technikąmożnawskazaćfragment
DNA,wktórymdoszłodozmianynawetjednegonu-
kleotydu,aleanalizowanezamplifikowanefragmenty
DNAmusząbyćkrótkie.Przybadaniufragmentów
DNAowielkości100–300parzasadmetodąmoż-
nazidentyfikowaćdo95%fragmentówozmienionej
sekwencji,aleprzyfragmentachowielkości300–450
parzasadwykrywalnośćspadaponiżej80%.Poelek-
troforeziekonformeryuwidaczniasięnajczęściejsre-
brzeniem.Obecnośćmutacjilubpolimorfizmu
wzmienionymkonformerzepotwierdzasięnadrodze
sekwencjonowania.
2050207
HD
Analizaheterodupleksów(HD)jest,podobniejak
SSCP,metodąprzesiewową.Możnazajejpomocą
badaćfragmentyowielkościpowyżej400parzasad.
Wprzypadkugdyjedenalleljesttypudzikiego,
adrugizmutowany,różniąsięonemiędzysobąse-
kwencją.WmetodziePCR-HDproduktyPCRde-
naturowane,anastępnie,przypowolnymschładza-
niu,poszczególnenicihybrydyzująlosowowtaki
sposób,żenastępujehybrydyzacjanicikomplemen-
tarnychorazniekomplementarnych,tj.niciprawidło-
wejizmutowanej(heterodupleks).Wheteroduplek-
sienaniesparowanymodcinkuniciDNAdochodzi
dopowstaniaobustronnegowybrzuszenia(przymu-
tacjachtypusubstytucji),ugięcianiciDNAlubjed-
nostronnegowybrzuszenia(delecjelubinsercje).
Podczaselektroforezywżelupoliakryloamidowym
heterodupleksymigrująinaczejniżhomodupleksy.
Ostatecznieobecnośćmutacjilubpolimorfizmupo-
twierdzasięsekwencjonowaniem.
2050208
SekwencjonowanieDNA
SekwencjonowanieDNAjestjednązpodstawo-
wychtechnikgenetykimolekularnejipozwalana
bezpośredniewykazaniezmianwDNA.Opracowano
Ryci2i4iPCR-HD-rozdziałelektroforetycznyisekwencjonowanie.Naobraziepoprawejstroniezaznaczonoheterodupleks
zproduktuPCRdlaeksonu23genuCOL9A3.Analizasekwencyjna(polewej)uchoregozwielonasadowądysplazjąkostną
wykazałapunktowąmutacjęsubstytucyjnąG
A(adeninazastąpionaguaniną),któraspowodowałazamianęaminokwasu
argininydoglicynywkodowanymbiałku(obrazgórny).Poniżejtasamasekwencjaprawidłowa(rycinapochodzizrozprawy
doktorskiejM.Czarny-Ratajczak).
GENETYKAWREUMATOLOGII49